실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-
crispr
(비회원)
-
17.02.03 10:33
puromycin selection의 경우 초기 selection이후 지속적으로 cell media에 puromycin을 사용했다면 stable cell line 상퇴가 되므로 plasmid dna가 gene에 integration 되기 때문에 negative control 이 필요합니다. 그런데 이런 경우 cas9 protein등 다른 단백질도 발현될 수 있어서 추천드리지 않습니다.
따라서 초기 1phase 2phase에 selection 이후에는 일반 미디어를 사용하시면 됩니다.
저의 질문의 방향은 이것입니다. KO된 셀들이 HDR plasmid에 의해 가지고 있을 여러 요소(ex. puromycin, etc)들이 xenograft 실험에서 영향을 주는가 아닌가의 지표로써 사용할 수 있는 negative control을 만들려고 합니다.
즉, negative control
vs KO-cell
gene이 정상작동 Yes No
HDR plasmid 사용* Yes Yes
*제가 사용한 CRISPR/Cas9 system이 산타크루즈에서 온것인데, 이 시스템은 HDR 안에 puromycin 과 기타 요소들이 함께 있어 gRNA가 표지되어 있는 Cas9 vector에 의해 잘린 지역에 끼어들어가게 되기 때문에 HDR plasmid 사용여부를 목록에 첨가한 것임.제가 구글링을 했을 때 보니, negative control을 만들기 위해 intron 지역의 gRNA와 HDR plasmid를 만들어서 한다고도 하는데, 시간이 없다보니 그런 복잡한 방법 말곤 없을까 해서 글을 올린 것입니다. 혹시 이거에 관해서 코멘트 해주실 수 있으신가요?