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Real time PCR의 시작부터 결과값을 해석할 때 고려해야 할 항목은 여러 가지가 있습니다. 효과적인 실험 디자인 방법, Probe 선택, Primer 디자인 방법, Ct 값 분석, Melting curve peak 등 정확한 데이터를 얻기 위한 여러 가지 비결을 공유해 주세요.
제안자 BRIC (2014.04.02) |
(본 자료는 예전 실험Talk에서 이관되었습니다.)
[기본원리]
안녕하세요. 서린바이오사이언스입니다.
Real time PCR 실험기본 원리와 과정에 대해 도움이 되실 자료 공유합니다.^^
하기 링크에서 첨부파일 다운 받으실 수 있습니다.
http://www.seoulin.co.kr/promotion/ectlog.php
문의사항이 있으시다면 서린바이오사이언스로 연락 주시기 바랍니다.
대표번호: 1670-5911 |
| (주)서린바이오사이언스 (2015-12-30 10:51) |
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[기본원리]
qPCR에서 위에서 작성하신 분 말대로.. 깨끗한 One peak가 나오는게 가장 이상적이지만,
그러지 않을 경우가 많습니다.
1. Primer의 dimer, 2 peak가 뜨며, 결과 신뢰도 0%입니다.
2. RNA의 splicing miss, RNA의 성숙화 과정에서 생긴 오류로, 타겟의 Peak보다 더 뒤에 뜸..
3. High CT value, 1 peak가 깨끗하게 뜬다는건, 형광의 세기가 쌜때 깨끗하게 나타납니다.
즉.. CT값이 낮을을 수록 Peak의 최대지점이 올라가고, CT값이 높을수록 Peak의 최대지점이 낮아집니다. 따라서 CT값이 높으면, One peak가 퍼져서 나타납니다.
해결방법은.. 1번은 Primer를 다시 디자인.. 2번은 RNA를 다시 뽑아야하며, 3번은
cDNA양을 늘리셔야 합니다.
위에서 CT값이 30이상일 경우와 35이상일 경우 sample수를 늘려주신다고 하셨는데..
sample수를 늘린다고 결과값이 보증되진 않습니다. 그것보다 cDNA양을 늘려서
CT 값을 조금이라도 앞으로 땡겨오는게 가장 좋은 해결책입니다.
CT값이 35이상일 경우 실제 qPCR에 들어간 Target cDNA는 1가닥~3가닥 사이입니다.
굉장히 오차가 심하게 되고, 결과값도 신뢰하기 어렵습니다.
그리고 깨끗한 One peak가 나오지 않는다면.. 대부분 Master mix의 성능이 안좋아서
그렇습니다. 전 시중에 나와있는 5개 이상의 제품에 대해서 비교를 해봤는데 제품마다
차이가 심했습니다. 어디 제품이 좋다라고는 쓰지 않겠지만, One peak 이후.. 90도 부근에서
자잘한 Peak가 다시 나온다면 Master mix를 바꾸시길 추천드립니다. |
| 지나가며.. (2015-09-14 16:33) |
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[나만의 노하우]
제가 잘하고 있는것인가, 바꿔야 할 조건은 있는가 싶어서 조심스레 올려봅니다.
또한 제일 아래에 질문할 것도 있습니다...
노하우란이기에 제가 생각할 때 중요한것들은 글씨굵게 했습니다.
저는 기계는 Roche Light Cycler, 검출법은 CYBR green을 사용합니다.
mitochondria copynumber와 telomere length 측정만 하는 초보 사용자입니다.
<조건>
Total양
권장이 total 20㎕이지만 저는 total을 반으로 줄여서 total 10㎕으로 사용하고 있습니다. <<시약이 비싸서 그런듯합니다.
DNA양
<Do not use more than 50 ng of complex genomic DNA in a 20㎕ reaction volume.(Roche CYBR green manual 발췌)>
위를 근거로 DNA양은 total 10㎕일 때 20ng을 넣고 있습니다.
※cDNA는 500ng이하로 사용하는 것으로 알고있습니다. 저는 gDNA만 사용했습니다.
Product size
거의다 100~200bp이고, 길이만 맞다면 일반PCR했던 primer도 가져다 쓰고 있습니다.
최대 300bp 이하로 하고있습니다.
MgCl
아래표에서 2mM이 되게 하고있습니다. (Roche CYBR green manual 발췌)
MgCl이 많으면 nonspecific, 적으면 no peak(no band)가 나오더라고요.
CT값에서도 근소한 영향을 줍니다. 3mM일 때 1~2 CT값 낮아졌습니다. 더 높은 농도에서는 melting peak 과다하게 나왔습니다.
프라이머
10pmol 희석했을 때 0.5ul를 사용하고 있습니다. final 0.5uM.
Negative control
DNA만 넣지 않은 것을 같이 돌려줍니다. manual에도 꼭 넣으라고 되어있습니다.
primer dimer를 확인하기 위해서라고 알고 있습니다.
<결과해석>
CT값
30이상은 신뢰성이 부족하다고 보고, sample수를 배로 늘려야 한다고 합니다.
30~35는 sample수 2개, 35이상은 sample수 3개.
그래서 저는 CT값을 15~25사이에 올수 있게 DNA양, 프라이머양, MgCl값을 허용범위 내에서 조정합니다.
그래도 15~25사이에 안들어올때는 pimer를 재설계해서 product size를 늘리거나 줄이거나 하고있습니다.
또한 sample수를 2개씩 하여서 두 개의 CT값 차이가 0.5이하일 때 실험이 잘되었다고 보고 있습니다.
melting curve
무조건 단일 피크가 나오게 합니다. 날씬한 종형만들기까지는 못하고 있습니다.
피크가 많을시 온도를 2도씩 올려주고 있습니다.
피크가 적을시 온도를 2도씩 내려주고 있습니다.
그래도 안나오면 넓은 온도 범위로 gradient PCR합니다.
그래도 안나오면 프라이머 다시 제작합니다.
melting peaks가 날씬한 종형이 아닐때는 melting 측정온도를 60~95℃, ramp rate를 0.2℃/sec로 바꾸는 꼼수도 부려봤습니다. (기본값 65~95℃, 0.1℃/sec)
서두없는 중구난방인 글 읽어주셔서 감사합니다.
<질문>
최대형광검출값
최대로 올라가는 값 이건 도저히 안맞춰지더라고요.
다른 사람들은 잘만 맞추던데.
이렇게 나오는 이유를 알고싶습니다....
2개씩 샘플을 돌릴 때 그 2개의 최대값은 거의 일정했습니다. 그러면 DNA의 차이인가요?
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 대학원석사 (2014-04-04 12:15) |
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[기본원리]
무엇보다 RNA prep이 중요하죠
RNA는 DNA처럼 안정한 상태가 아닌 single strand의 불안정한 상태이기 때문에 degradation이 쉽게 일어나기 때문에 이를 방지하기 위하여 기초적인 부분에서 주의할 부분이 있습니다.
- prep 전 사용되는 모든 공간, 기기 등은 70% EtOH을 이용해 닦아 RNase를 제거
- Nuclease-free lab ware를 사용
- latex glove 착용
- RNase-free reagents 사용
- RNAse inhibitor 사용
- column based DNA/RNA extraction kit 사용 |
 ralaman (2014-04-03 16:41) |
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[기본원리]
cycle 별 증폭량은 초기 존재량에 비례한다는 것을 이용한 것이 real-time PCR입니다.
하지만 이경우, 만약 cDNA sample이 RT를 한것이라면 반드시 그렇지 않을 수도 있습니다.
그 이유는 RTase는 denature가 된 상태라도 Taq의 활성을 저해 할 수 있기 때문입니다
엘피스바이오텍 글 발췌 |
 BRIC (2014-04-02 11:43) |
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[기본원리]
PCR과 primer 자체는 같습니다. 다만 Real Time의 경우에는 PCR을 통해 복제되는 사이즈가 100~300 bp정도를 사용하는 것이 보편적입니다. TM 과 기타 다른 종류는 일반 PCR과 같다고 보시면 되고 최근에는 다양한 사이트에서 Real Time PCR 프라이머를 만들어주는 곳도 있습니다. http://eu.idtdna.com/site 참고하여 보세요 관련 내용과 프로그램, ref 도 다 들어있습니다
하르방님 글 발췌 |
| BRIC (2014-04-02 11:38) |
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