실험 Q&A Immunology > Immunocytochemistry
Immunostaining에 관한 노하우를 나누어 주세요~~~
salight (비회원)
연구자의 목적이나 연구 소재에 따라서 여러가지 방법으로 진행되는 Immunostaining 실험 기법에 대하여, 조직이나 세포 종류에 따른 실험 방법, 실험시 유의점, 관련 실험제품, 참고자료 등등 Immunostaining 시 필요한 정보들을 공유해 주세요. 제안자 salight (2015.03.04) |
[기본원리] 안녕하세요. 서린바이오사이언스입니다. Immunostaining 중 Immunohistochemistry (IHC) 관련된 실험기본 원리와 과정에 대해 도움이 되실 자료 공유합니다.^^ 하기 링크에서 첨부파일 다운 받으실 수 있습니다. http://www.seoulin.co.kr/shop/board/view.php?id=TechnicalDocument&no=202 문의사항이 있으시다면 서린바이오사이언스로 연락 주시기 바랍니다. 대표번호: 1670-5911 | |
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[기본원리] Immunofluorescence Cell이나 tissue 내의 target protein을 detection하는 대표적인 방법으로 Immunohistochemistry(IHC)와 Immunofluorescence(IF)를 꼽을 수 있겠습니다. IF는 IHC의 한 방법으로써 enzyme을 사용하는 것이 아니라 fluorophore가 결합된 antibody를 사용하여 형광현미경 하에서 target protein의 위치를 detection하는 방법입니다. Fluorophore(형광 dye)는 특정 파장의 빛을 흡수하여 그 파장대에 따라 다른 색을 나타냅니다. 본 protocol에서는 Cell Signaling 사가 제공하는 IF 실험방법에 및 몇가지 정보에 대해 소개하도록 하겠습니다.
Immunofluorescence staining
A. Solutions and Reagents 정제된 D.W로 solution을 준비한다.
NOTE: primary 또는 fluorochrome-conjugated secondary antibody를 처음 사용할 때는, 최소의 background를 갖는 최대의 signal을 나타내기 위한 dilution을 결정하기 위해 ritration을 해보는 것이 좋다.
B. Specimen Preparation I. Cultured Cell Lines (IF-IC)
NOTE: Formaldehyde는 toxic 하므로, hood에서 작업하도록 한다.
II. Paraffin Sections (IF-P) Deparaffinization/Rehydration:
Antigen Unmasking:
III. Frozen/Cryostat Sections (IF-F)
NOTE: Formaldehyde는 toxic 하므로, hood에서 작업하도록 한다.
C. Immunostaining NOTE: 다른 공지가 없는 한 이어지는 모든 incubation 단계는 RT에서 수행된다.
OPTION: background staining을 줄이려면, 2번째 PBS washing 이후 high salt PBS로 2 min 동안 washing 한다. NOTE: 만약 Alexa Fluor® fluorochrome이 직접 conjugation 된 primary antibody를 사용한다면, step 8로 넘어가도록 한다.
OPTION: background staining을 줄이려면, 2번째 PBS washing 이후 high salt PBS로 2 min 동안 washing 한다.
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[나만의 노하우] 1. 그룹간 발현 차이를 보고싶은데 두 그룹 모두에서 발현되는 항원일 경우 희석을 많이 해서 base 발색을 확 낮추면 관찰이 용이합니다. 2. 같은 실험을 반복하는데도 발색력이 다를 경우 항원 복원 시약 재사용을 하지 않으면, 재현성을 높일 수 있습니다. 3. 배경염색이 심할 경우 아예 detection kit을 바꾸거나 1차 항체를 바꾸시는게 더 빠릅니다. 조건 잡는 시간이 더 걸립니다. 4. Wash 효과는 버퍼에 담가만 놓아도 됩니다. 10분 정도 충분한 wash buffer에 슬라이드 두시면 됩니다. 단 시약이 바뀔때마다 버려주세요. 5. 배경염색이 심할 경우 detection, 항체 바꿔도 해결되지 않을 때 wash buffer의 salt 양을 2배 정도 늘려서 사용해 보시면 줄어듭니다. 6. Pap pen은 tween 20이 들어간 buffer에 담갔던 슬라이드에 사용 시 조직 위로 기름때처럼 번짐의 우려가 있습니다. 반드시 슬라이드는 DW또는 tap water상태에서 물기 제거 후 테두리를 그리고, 원 보다는 사각형 모양으로 그려주세요. 항체가 가운데로 모이는 현상 (가운데만 진하게 염색이 됨)이 거의 없어집니다. pen 보관은 촉 부분이 위로 가도록 세워서 보관, 사용 시 잘 안나올 경우 티슈에 콕콕 (꾹~~~아닙니다)찍어서 펜 촉 부분이 젖을 정도로만 나오게 해서 사용하시면 조직에 pen 성분이 덮여 염색이 안되는 현상을 막아 슬라이드를 안전하게 보호 (?) 할 수 있습니다. 7. ABC, LSAB법 보다는 polymer가 (GBI 추천) 좋으나 분자량이 커서 슬라이드 주변에 붙어 배경염색의 원인이 되기도 합니다. wash buffer에 10분 씩 2번 이상 담가두시면 제거됩니다. 8. 모든 면역염색은 코팅이 잘 되고, 잘 부착된 조직이어야 잘 됩니다. 고품질의 코팅 슬라이드와 충분한 dry를 거친 슬라이드로 염색하시면 조직 손상 없이 이쁜 그림 만들 수 있습니다. 9. Hematoxylin Mayer's는 TBST에 담가두시면 또는 뜨거운 물에 담가두시면 보라색에서 파란색으로 변합니다. 10. 영구적 봉입제 사용 시 무수에탄올 사용하지 않으면 기름 방울이 동동 뜹니다. 반드시 무수에탄올 (실험 종료 후 탈수 과정 시 바로 넣어도 괜찮음) 2번 이상 (각기 다른 용기에 담궈진) 처리를 한 후 자일렌에 2번 이상 deeping 후 덮으면 됩니다. 영구 봉입제 안에 xylene 성분이 들어가 있어 굳기 쉽습니다. Mouting medium이 너무 찐득거릴 경우 xylene을 부어 천천히 녹여 묽게 타서 쓰시면 오래 쓸 수 있습니다. | |
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[나만의 노하우] Target protein이 Neurotransmitter와 같은 경우 때에 따라서는 protease K를 오히려 사용하지 말아야 될 경우가 있습니다. 조직에서 단백질이 깨져버려 오히려 IHC에서 나오지 않습니다. | |
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[관련자료 링크] Human Protein Atlas라는 세계적인 단백질 연구그룹에서 인간 단백질에 대한 15,000 종 이상의 IHC에 특화된 항체를 개발하였고 각 항체당 700여장의 IHC 이미지를 제공하고 있습니다. 연구하고자 하는 단백질을 검색하면 간단한 유전/단백질 정보와 함께 정상조직 및 다양한 암조직/ 암세포 등에 대한 IHC 결과를 확인하실 수 있습니다. DATA 열람은 무료이며 www.proteinatlas.org , 항체가 필요하시면 아시아 대리점인 앱클론(주) www.abclon.com 에 문의하시면 구매가 가능합니다. | |
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[나만의 노하우] membrain protein, 즉 예를 들면 channel protein 보실때 triton을 보통 0.3% 쓰신다면, 0.1%로 줄여서 써주셔야.. 염색이 잘 된답니다~ | |
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[나만의 노하우] Triton은 cell에 구멍을 뚫어줍니다. 항체가 이동할 수 있는 통로를 만들어 주는 것으로 너무 크게 뚫으면 cell이 손상되고 너무 작은면 항체가 이동하기 어렵습니다. Triton처리 시간과 농도가 성공의 키가 되는 노하우 입니다. 엘피스님 글 발췌 | |
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[나만의 노하우] 세포가 약간 다른 것으로 오염이 되면 그런 백그라운드가 생길 가능성이 있습니다. 세포가 우선 깨끗한지 부터 확인해 보세요. 그리고 fixation하기 전에 washing을 충분히 해주는 것도 한가지 방법입니다. 아이피님 글 발췌 | |
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[관련자료 링크] Antibody 를 이용한 Application 에 대한 Technical Tip 을 확인하실 수 있습니다.
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