IHC 진행중인데 background가 너무 심해서 고민중입니다.

secondary antibody만 넣었는데도 형광이 쨍쨍하게 보입니다.

뭐가 문제인지 확인 부탁드립니다.

xylene 10min x2

100 EtOH 10min x2

95% EtOH 5min 

70% EtOH 5min 

50% EtOH 5min

tap water 5min

antigen retrival(using pressure cooker) 3min with sodium citrate buffer

wash tap water 10min

blocking 5% normal goat serum in PBS 1h

primary ab (dilution buffer 1% BSA in TBS) 4도 O/N in humidity chamber

wash 0.025% tween 20/PBS 10min x3 with agitation

secondary ab(dilution buffer 1% BSA in TBS) 30min at RT with agitation

wash 0.025% tween 20/PBS 10min x3 with agitaion 

이렇게 했는데

secondary ab만 넣었을 때도 나오고 488 1:10,000 

594 파장에서는 primary를 추가해서 실험했을때

primary 1:100, secondary 1:1000에서 원하는 결과는 핵에서 보여야 하는데 세포전반적으로 보여서 문제입니다.

어떻게 문제인지 알려주세요ㅠㅠ