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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 3509  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 PCR 결과좀 봐주세요
PCR  | 2008.10.07 22:56
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 11-19.bmp (725 KB)
cDNA를 주형으로 PCR을 진행했습니다.
30cycle을 진행했구요
94--30초
annealing time--45초
72--30초로 했습니다.

gel의 well은 가장 작은것을 이용했구요 loading양은 5ul로 했습니다.
multi-channel로 건 쪽에서는 끌리는 것도 많이 나오고 밴드가 이상한 모양으로
나와서 밴드 두께를 구분하기가 쉽지 않은데요
로딩양이 너무 많아서 저렇게 나오는 건가요??
그리고 다른 한가지는 여러가지 multi band가 나왔는데요
annealing온도를 약 60도로 했거든요
annealing온도를 좀 더 올려야 하나요??
부디 잘 아시는 고수님들 답변 부탁드릴꼐요~~~

쌀쌀한 날씨에 감기 조심하시구요~~
감사합니다~~
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리발그런  |  2008.10.07   

일단 annealing온도를 높여보는 것도 문제를 푸는 하나의 방법이기는 합니다.
하지만 그 이외의 다른 여러 요소들도 고려를 하셔야합니다.

프라이머의 농도, extension시간, cycle 수

이런것들을 변경해보아도 잘 나오지 않으면 프라이머를 다시 제작하시는게
제일 속편한 방법이지요^^
개구리몽글이맘  |  2008.10.08   
primer가 제대로 제작되었다면, annealing 온도는 중요하지 않습니다.
gradient 로 걸어도 미세한 차이만 있을뿐. GC content 의 적절함에 따른 온도는 거의 60도 내외이고, 오차범위가 최소 4도 차이가 나도 60도에서 잘 걸립니다.

위 결과로는 annealing을 바꾼다고 해서 그리 나아질것 같지 않습니다.
primer 디자인을 새로 하십시요. 또한 전기영동시 voltage는 얼마로 하셨나요?
marker도 많이 끌리는군요.

good luck
대왕개구리엘피스  |  2008.10.08   
PCR cycle을 줄여보세요.

첫번째 사진의 오른쪽 샘플들을 보면 specific band보다는 non-specific band가 더 많게 나오는데 이는 않나와야 할 것이 과도한 증폭과정에서 non-specific으로 나온 것 같습니다.

PCR조건은 적당하다고 보며 그 이유는 다른 샘플들에서 specific band가 아무리 많더라도 다른 band들이 보이지 않기 때문입니다.

PCR cycle이 지나치게 많으면 아주 적은 non-specific도 과장되어 나타나게 마련입니다.
PCR  |  2008.10.08    
우선 답변에 감사드립니다.
이른 시간이라 답변이 안올라왔을줄 알고 그냥 들어와봤는데 답변글이 많이 올라와 있네요~~~^^완전 감동입니다~~^^감사합니다.

PCR mixture를 로딩할때 좀 넓은 well을 이용해서 전기영동을 하면 사진의 오른쪽 밴드처럼 이상한 모양으로는 안나오거든요 밴드가 깨끗하게 나오는데 sample이 워낙 많다 보니 좁은 well로 전기영동을 하면 저렇게 나오더라고요
왼쪽 sample은 답변주신 분들 말씀대로 cycle좀 줄이고 annealing온도를 약간 더 올려서 다시 한번 해보겠습니다. 그런데 오른쪽 사진은 아직도 갈피를 못잡겠네요 ㅡㅡ;
전기영동 시에 sample loading양이 많아지면 오른쪽 사진처럼 밴드가 불꽃(?)모양으로 내려가게 되나요? 훔 참고로 전기영동은 100V로 걸었습니다.
오른쪽 데이타도 cycle수도 좀 줄이고 sample loading양도 좀 줄여서 다시 진행해보겠습니다.

정성껏 질문에 답변해주신 고수님들 정말 감사하구요~
많은 도움이 된거 같아요~~~^^
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