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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 westernblot시 매번 background가 다 탑니다ㅠ
알실험초보1(대학원생)  | 2019.09.09 16:15
첨부파일 파일첨부: 1568013331069.jpg (68 KB)
이미지 첨부파일
blocking (1시간 30분) 5% skim milk (with tbst)로 하고
primary antibody (1:1000)으로 blocking solution에 녹여서 14시간 4도에서 overnight하고
워싱 3번 10min 후에
secondary antibody (1:10000)으로 blocking solution에 녹여서 1시간 RT에서 shaking한 후에 워싱 3번 10min 진행하고
ECL solution (1:1)로 섞어서 1ml 뿌려서
xray film 위에 두고 현상합니다.
그런데 background가 매번 다 타서 전혀 형체를 알아볼 수 없습니다.
고수님들 도와주세요ㅠ
#westernblot
 
#background
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.09.09   

일단 항체를 재활용 하시나요? 아니면 새로 만들어서 사용해도 저렇게 나오는지 확인이 필요할듯 합니다... 블라킹 버퍼가 오염되면(상하면) 저렇게 나오는 경우가 있습니다.

또 결과만 가지고 어느과정에서 잘못되었다 말하기가 어렵습니다. 주어진 정보가 너무 적네요...

일단 실험항체만 그런지 다른 항체도 이런 문제를 나타내는지 확인이 요구되겠죠.

다른 항체로도 같은 현상이면 실험법이 문제고... 그렇지 않다면 항체 문제 일수 있습니다... 이부분부터 확인해보세요...

 

ㄸ치  |  2019.09.11    

ECL을 더 약한걸로 바꿔야할 것 같습니다

개구리DTer  |  2019.09.11   

발색을 나타내는 직접적인 원인은 2차 항체에 결합된 효소 (주로 HRP)에 의한 것이며, 2차 항체가 membrane에 결합하는 이유는 1차 항체를 인식하여 특이적으로 결합하거나 그냥 membrane에 비특이적으로 결합하는 경우, 2가지입니다.

특이적인 band들이 보이고 membrane의 일부분에서만 background가 보이므로, background가 보이는 부분이 제대로 blocking이 되지 않았거나, washing이되지 않았을 경우에 나타나는 현상입니다.

Membrane의 가장 자리를 제외한 내부가 blocking 혹은 washing이 잘 되지 않는 원인은 해당 실험 방법에 문제가 있는 경우입니다.

즉, blocking 혹은 washing buffer가 적거나 shaking이 충분히 강하지 않을 경우 membrane이 tray에 붙어 내부 쪽 buffer 교환이 잘 일어나지 않습니다. 그럴 경우 내부 쪽만 background가 강하게 나타납니다.

해결 방법은, blocking과 washing 시 tray를 membrane이 충분히 잘 shaking 될 수 있도록 적절한 크기를 사용하고, buffer 양도 충분히 하여 membrane 중간 부분까지 buffer 교환이 잘 되게 하는 것이 도움이 됩니다.

Orbital shaker보다 앞뒤 혹은 좌우로 shaking해 주는 rocker가 더 좋은 방법이 될 수 있습니다.

Background외에 다양한 band가 보이는 것으로 봐서는 1차 항체도 좀 더 특이적인 다른 회사제품을 고려할 필요가 있어 보입니다.

알실험초보1  |  2019.09.13   
모두 정말 감사합니다!
1Ab는 새것을 써도 저렇게 나와서 걱정입니다ㅠ
좌우로 shaking 40RPM으로 하고 있는데도 저렇게 나오는데 buffer양을 충분히 늘려서 다시 해보겠습니다:)
개구리순똘  |  2019.09.16   
2차 항체의 비특이적, 혹은 약한 결합에 의한것들은 워싱을 더 해주거나 항체의 농도를 낮춤으로 해결 될 수 있습니다.
윗분 조언에 추가조언드리자먄,
1차 2차 항체의 농도를 더 낮춰보세요. 특히 2차.
2차를 1:2만 또는 3만까지 해보시고, 밴드가너무 약하다먄 expose time을 늘리시면 됩니다.

그리고 워싱도 4번까지 해보세요. 특히 2차항체 처리후에요. 첫번째 워싱은 10분 안해도 되고 10초만 해주셔도 워싱효과가 좋습니다. 처음을 10초만 하신다먄, 4번 워싱을 하더라도 3번하는것과 비슷한 시간에 워싱을 완료할 수 있습니다.
알실험초보1  |  2019.09.18   
첨부파일 파일첨부: 20190917_152415.jpg (1,928 KB)
이미지 첨부파일
roker 40rpm 이용하여
blocking solution (5% skim milk)로 1시간 30분 ~ 2시간처리하고 새로 1Ab을 1:5000으로 희석하여 4도 냉장고에서 14시간 오버나잇하고 washing은 tbst로 (10분 3번) 하고 2Ab은 1:5만으로 희석하여 (5% skim milk solution) 1시간 처리하고 다시 워싱을 tbst로 10분 4번하고 ecl 1:1로 섞어서 사용하여 짧은 시간을 현상해도 얼룩이 여전히 심합니다ㅠㅠㅠ
워싱 시간을 늘리고 블라킹 시간을 늘려도 얼룩이 너무 심한데 다른 문제가 있는 걸까요?ㅠㅠ
저는 미생물 연구실이라 웨스턴은 연구실 내에 저 혼자 하여 물어볼 곳이 없어 여기에 올립니다ㅠㅠ
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