Crispr cas9 관련 K/O 실험 진행중에 있습니다.

K/O하는 gene은 chromatin remodeling complex 관련 gene이구요.

K/O여부를 쉽게 확인하기 위해 GFP 및 flag taaging 된 Cripr cas9 vector를 업체통해 제작한 뒤 실험에 사용했습니다.

일단 cancer cell에 사용하기 전에 vector working 부터 확인 하기 위해 293TN에 transfection 한 뒤 GFP가 발현 되는 것을 확인 하였고, protein을 걷어서 flag가 뜨는 것을 확인 하였습니다. vector에 문제가 없다는 것으로 여기고..

cancer cell에 transfection을 진행 했습니다. 293TN보다는 transfection 효율이 떨어지는 했지만.. GFP posotive한 부분을 FACS로 sorting 한 뒤 single cell을 키워 확인하려 했는데... GFP가 cell을 키울수록 사라졌네요..;;;

GFP가 사라졌지만 혹시나 해서 single cell을 계속 키웠고.. 다행히 expansion이 잘되서  K/O level을  qRT-PCR 및 western을 통해 관련된 gene level이  k/o 되는 것을 확인 했습니다..

하지만.. GFP 발현은 안되고.. flag가 western에서 잡히질 않네요?

이럴수가 있을까요?

과연 이것을 K/O 되었다고 봐야 할지 정말 아리송 하네요...

고수님들 답변 부탁드려요