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전 과정 중에서 이 단계가 제일 어려운 것 같습니다. 어떤 품질과 양으로 cDNA가 합성 정제되고 있는지 확인하기가 모호하니까요. cDNA library를 만들때 trouble shooting 요점을 생각해봤습니다.
1) 로딩한 DNA 양 부족?
컬럼 로딩 전에 double-stranded cDNA 증폭을 하잖아요? 그때 몇사이클을 돌렸으며, 증폭된 양은 얼마나 되었나요? 이 때 못해도 50 microgram은 넘어야 할 겁니다. EtBr agarose plate에 점으로 찍어서 (양을 알고 있는 마커와 비교해서) 대략 추정가능합니다. TAKARA 매뉴얼 뒤에 있는 trouble shooting을 보니, full length RNA 품질과 double strand cDNA 합성 불량이 지적되어 있네요. 전기영동 상에서는 ss cDNA와 ds cDNA 구분이 안되니까, SMART cDNA 합성 원리 상 RNA로까지 올라가서 따져야 하겠네요.
2) 컬럼 취급 문제?
equilibration이 중요합니다. 절대 마르면 안되고, 또 스윙버킷 로터가 좋습니다. 실험이 끝난 후에도 trouble shooting을 위해서 컬럼을 1X STE 버퍼를 약간만 적셔서 냉장보관해 두세요.
3) Elution 부족?
첫번째 elution 후에 STE buffer(100mM NaCl, 20 mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.0)을 약간 더 추가해서 elution을 한번 더 해보세요. 부피가 늘어나서 농도가 희석될 수 있는데, 알콜 침전은 o/n으로, 원심분리도 1시간까지 시간을 늘릴 수 있겠습니다.