아래 질문과 같은 건가요?

3.5kb를 T-vector로 넣기 어렵습니다. 안되는 건 아니지만, 글 내용으로 추측컨대 아직 DNA 다루는 일이 숙달되지 않은 듯 해서요. 우선적으로 제한효소 2-cut으로 넣는 걸 생각해 보세요.

일반적인 Taq DNA polymerase로 유전자 클로닝 하는 건 현명한 방법이 아닙니다. 에러가 생기면 곤란한 경우가 생깁니다. 사용하던 Phusion High Fidelity DNA polymerase를 구매하시는 게 좋습니다. 

Phusion DNA polymerase는 굉장히 좋은 제품입니다. 가격은 부담되죠. 그러니까 실험 설계를 잘 해야 합니다. PCR 실험에서 설계란 것은 대체로는 프라이머를 잘 짜야 한다는 뜻이기도 합니다. 

구조가 복잡한 식물 genomic DNA에서 PCR이 안되는 경우가 다양하지만, 안될 때는 정말 안되기도 합니다. 예를 들어서 GC가 엄청 높거나, 프라이머 자리에 GC%가 너무 낮거나, 반복서열이 있거나 하면 일이 어려워 집니다. 인트론에 뭔가 복잡한 구조가 있을 수 있다던 슈퍼바이저의 지적은 좋았습니다. 어쨌거나 이걸 풀어가야 하는데, 앞의 질문에서 overlap fusion PCR로 이어 붙이는 것을 어느정도 잘 했다고 했죠? 그 것을 주형으로 다시 PCR 증폭을 하면 좋았을 겁니다.

또 이럴 때는 Nested primer PCR을 하면 증폭이 어려웠던 1차 PCR의 프라이머 binding 문제를 풀 수 있습니다. 이것은 overlap fusion PCR에도 적용되겠지만, 그냥 end-to-end PCR을 한번에 다시 해볼만도 합니다. 

Populus tremula 종이이면 genome이 나와 있으니, 아마 그 서열에서 primer를 짜셨을 테죠. 다행히 genome 서열이 있으니, 그 유전자 모델을 보고서, 클로닝할 서열 부분의 앞뒤로 약간 여유를 둬서 이상적인 프라이머를 만들고, 이것으로 1차 PCR을 하세요. 그게 밴드가 나왔다면, 원래 클로닝하려고 했던 부분의 프라이머로 2차 PCR을 하면 대개 잘 나옵니다. 이때 조금 따져봐야 할 것이 참조 유전체의 서열이 내가 주형으로 삼은 개체의 것과 같을지 입니다. 예측이 어렵다면 exon처럼 서열이 잘 보존된 부분을 사용해야 하겠죠. 

벡터는 pBluescript 같은 일반적인 것에 2-cut으로 넣어도 됩니다. 이때는 형질전환용 binary vector의 제한효소 자리를 신경써야 하겠죠. 

Gateway나 TOPO 클로닝 방법을 쓸 수 있다면 그쪽의 벡터체계를 사용해서 조금 수월하게 할 수도 있고요.

더 신기한 방법들이 많지만, 아무튼! 지금 상황에선 우선 PCR을 하는 것이 중요하겠네요. 

 

A whole gene amplification from gDNA가 한달째 안됩니다 ㅠㅠ 도와주세요.
독일유학생(대학원생)  | 11.18 06:46
안녕하세요. 독일에서 식물 분자생물학을 전공하는 마스터 학생입니다. In vivo, overexpression 실험을 위해서 Transformation 전에 Promoter region이 포함된 전체 gene을 gDNA에서 증폭하려고 하는데요. 3.5kb 밖에 안되는 유전자가 도통 증폭이 되지 않습니다. 웃긴거는 같은 프로토콜로 다른 genus에 하면 결과가 나오는데 지금 제가 필요로하는  Poplar의 한 종에서만 이게 정말로 안됩니다. 슈퍼바이저와 테크니션들과 엄청나게 많이 토론하고 대안으로 생각한게 fusion PCR인데 한 gene을 A와 B 두 파트로 나눠서 다른 두 프라이머 set으로 증폭한다음에 두 Fragments를 함께넣어서 처음과 끝 프라이머로 두파트를 이엇습니다. 처음에 전체 유전자를 증폭했다는 사실에 엄청 기뻤는데, 클로닝으로 하려고 gel purificaiton 한 다음에 농도가 너무 낮고, 결국엔 클로닝에도 번번히 실패했습니다. 사용하는 중합효소는 Thermofisher Phusion-Taq 입니다. 슈퍼바이저 말로는 인트론 중에서 PCR을 방해하는 뭔가가 있을 수 있다는데 제 상식으로는 도대체 이해가 되지않습니다. 혹시 같은 경험이 있으시거나 해결방법을 아신다면 도와주세요!

- 증폭 target을 overexpression하려면 gDNA가 아니라 mRNA에서 cloning하지

않나요?

- 만약 증폭이 되었다면 E.coli에서 작업을 해야 하므로 E.coli용 cloning vector

어느것을 사용해도 무방합니다.

3.5kb 정도면 3kb 전후 vector에도 쉽게 넣을 수 있습니다.

- partial 중폭 및 연결을 하려면 개인적으로는 fusion PCR이 더 좋지 않을까

합니다. 

 

소중한 답변 정말 정말 감사합니다.

이 답변을 좀 더 빨리 봤더라면 어제 좀 더 많은 PCR을 했었을텐데 ㅠㅠ 너무 아쉽습니다.

제 두 질문이 사실 조금 관계가 없는거라 다시 좀 더 구체적으로 설명드릴게요.

답변해 주신대로 High fidelity가 얼마나 중요한지 수퍼바이저에게 지겹게 들어서 ㅎㅎ Phusion Pol을 다쓴다면 이번엔 Q5로 구매하려고 합니다. 비싸지만 정부에서 지원을 받는 산림청이기 때문에 200유로가 넘어가지 않는한 항상 쿨하게 주문하고 있습니다.

저희도 증폭이 너무 안되어서 GC 구성이 많아서 그런가 생각해봤는데 전체 gene의 32.67% 만 차지하고 있습니다. 제 생각엔 많은건 아닌거 같은데 많은거 인가요? 프라이머의 GC가 너무 낮은거는 말이 되는게 for 45%, rev 55% GC가 함유되어 있습니다. GC를 더 많게 다시 프라이머를 짜야할까요? 1kb가 안되는 증폭은 두 프라이머 각각 잘되고 있습니다. (이때까지 amplification한 fragments 사진을 첨부했습니다. 색깔 막대기들이 성공한 애들이고 작게 회색으로 있는 네모들이 엑손들 입니다. 원하는 전체 Gene은 #3178+3176 입니다.)

이미 존재하는 fragment를 주형으로 사용한다는 생각은 미처하지 못하였고, Nested primer PCR은 사실상 처음들어 봤습니다. 아무 흥미로운 아이디어라서 당장이라도 PCR해보고 싶네요! 정말 감사합니다. 이상적인 프라이머의 경우 GC가 얼마나 함유되있는게 좋은건가요? 저희는 보통 Primer3 웹사이트에서 디자인하기 때문에 제 스스로 결정한적은 아직 한번도 없습니다. 듣기로는 프라이머 첫, 끝 시퀀스는 G나 C로 하면 좋다는데 꼭 그래야하나요?

P. tremula genome같은 경우는 이미 popgenie 웹사이트에 있기도 하고, 저희 연구소에서 Nature Plant에 등재한적이 있어서 그때 MiniOn sequencing으로 database를 만들었습니다.

P. tremula genome 염기서열은 의심없이 바로 사용 할 수 있습니다.

여기까지 PCR을 만약에 해결했다면, pGEM-T Easy Vector로 클로닝하고 나중에 T-vector로 클로닝한다음 Poplar로 형질전환하는 아주 간단한 프로세스를 거치겠지만, 만약 그러지 못한다면...하고 고안해낸게 Gibson assembly였습니다.
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PCR을 한번에 성공 못시켰으니 이 gene을 앞, 뒤 두 파트로 나눠서 PCR한 다음, 그 둘을 이어부치는 실험을 하려고 합니다. 이때, backbone vector가 필요한데, 수퍼바이저 의견은 굳이 E. coli vector를 써야하나? 바로 Binary T-vector로 가면 안되나 하는 것입니다. Thermofisher에 따르면 10kb 까지는 아무 vector나 괜찮다라고 해서...혹시 선배님들중에 Gibson assembly를 T-vector랑 해보신 분이 계신지 여쪄보고 싶었습니다.



주절주절 길었지만 잘 읽어주셔서 정말 감사합니다. 선배님들의 의견이 제 실험들에 정말 많은 도움이 되고 있습니다. 타지에서 실험하고 있지만 선배님들이 계셔서 정말 든든합니다!

다시 한 번 정말 감사합니다!!!

genome browser가 무슨 프로그램인지, reference genome이 무엇인지 몰라서 섬세한 코멘트를 하기 어려워요. 

sex master gene이라고 했죠? 이게 유전자가 하나인가요? 아니면 여러 유전자가 몰려있는 클러스터 유전자좌인가요? 얼핏 생각하기에 S locus들은 주변에 재조합 빈도가 높은 반복서열들이 많이 있을 듯 한데, 이게 PCR에 영향을 주지 않았는지 한번 따져볼 필요가 있습니다. 그외에도 내부에 hairpin 구조가 있다던가, 안되는 이유가 있을 수 있겠습니다.

그렇지만, 3-5kb 정도를 클로닝 하는데 기술적인 대안들을 복잡하게 생각하기 시작하면 미궁의 수렁으로 빠집니다. 양쪽에 제한효소 넣고 PCR 하고, 이걸 무슨 벡터가 되었든 2-cut으로 넣겠다고 마음먹고 쭉 가세요. genomic DNA 조건(농도나 순도)과 DNA polymerase 종류(Phusion이나 Q5를 쓰고 결과 못내면 안되죠), 마지막으로 nested PCR 디자인만 잘하면 거의 됩니다. 

표준유전체 정보와 유전자 ID를 알려봐 주세요. 공개가 어려우면 쪽지라도 ...