1. 연구를 하면서 PCR로 cloning(원핵, 진핵)한 경험을 바탕으로 생각해

보면 GC%를 고려해 본적이 거의 없고 GC% 때문에 증폭이 안되는

경우도 없었습니다.

template DNA의 평균 GC가 32.67%면 높은 건 아니고 PCR에는 평균 GC%

보다 GC%가 높은 영역이 있는가를 중심으로 해석하는 것이 좋을 듯 합니다.

예로 평균 GC%는 높지 않은데 영역별 GC%가 70%이상인 경우 그 영역은

증폭에 문제가 생길 가능성이 높아지고 결과적으로 전체 증폭이 안되는

결과로 이어질수 있습니다.

또한 primer GC%는 신경쓰지 않아도 됩니다.

어차피 primer는 말그대로 template에 결합하여 DNA pol.의 primer역할의

담당하기 때문에 Tm을 기준으로 PCR하면 됩니다.

primer의 경우 GC% 보다 hairpin loop가 나오지 않게 하는 것이 더욱

중요합니다.

앞질문부터 답변을 드리고 있지만 너무 이론적인 것에 신경을 쓰는 느낌이

듭니다.

물론 이론도 중요하지만 실험은 실험 나름의 원칙과 기술을 바탕으로 해나가면

될것 같습니다.

따라서 GC%는 현재 실험문제점에 영향을 주지 않을 겁니다.

 

2. binary T-vector가 있으면 당연히 해당 vector를 사용해야겠죠.

없는경우라면 E.coli vector를 일반적으로 사용할겁니다.

 

3. 5kb이상 cloning 또는 fragment assembly에는 주로 fusion PCR을 사용했기

때문에 gibson assembly 부분은 다른 연구자 들이 도움을 주는 것이 좋을

듯 합니다.

 

증폭이 안된다는 것이 아예안된다는 것인가요 아니면 상당히 약하게 증폭이

된다는 뜻인가요?

현재 primer 보다 좀더 길게 디자인해서 실험해 보세요.

저는 Q5 pol 을쓰는데 Phusion pol이랑 같은지 모르겠지만 제 경험을 말씀드리자면... Q5 는 hot start가 가능한 폴이고 그걸 추천하더라구요. 처음엔 아무생각없이 그냥 시작부터 낮게 걸었는데 확실히 안되던것도 핫스타트 시키니 나오는 경우가 많았습니다. 그리고 Tm의 경우고 Taq보다 고온을 요구해서 제조사에나온 계산기로 계산을 하고 씁니다. 처음 쓸 때 Taq Tm으로 계산한 Tm을쓰면 안나오던것도 Q5 Tm으로 하니 나오더군요.... 즉 Phusion pol도 위 두가지 경우를 한 번 고려해 보시면 좋을 것 같습니다.

Gibson Assembly를 T vector랑 해 본적은 없지만, 오버랩 되는 부분만 있으면 잘 되더라구요. 물론 시퀀싱은 정말 철저하게 해야합니다.

저 같은 경우는 플라스미드 벡터를 백본으로 시작하면 PCR로 전체증폭시키고 오버랩 넣던지, 아니면 그냥 제한효소로 짜르고 fragments에 플라스미드 오버랩부분을 넣던지 해서 하기도 합니다.