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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western 결과 band가 아래에 뜨는 이유?
올챙이호안미로(대학생)  | 02.19 15:03
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20210219-145638~2.png (1.36 MB)
이미지 첨부파일
target protein은 약 130kDa 정도의 크기를 가진 p-jak 으로 웨스턴을 진행하였습니다.

7.5%gel에 전기영동후 1시간 트랜스퍼하여 항체를 실온 2시간 20분정도를 붙였고 희석은 5% bsa(in 0.05% pbst)하여 처리하였습니다. blocking은 5%bsa 그리고 워싱은 pbst로 10분마다 한 번씩 3번 진행하였습니다.

그 결과 사진처럼 band가 약 63kDa 근처에서 가장 진하게 나와 이유를 찾아보다 글을 올립니다..
130 근처에서도 희미하게 밴드가 보이기는하는데.. 그외 마커부분(75kda)에도 밴드가 조금 보이고 다른 크기의 밴드들도 잡히는 이유가 무엇인지 도통 감이 안잡힙니다.. (단순히 non specific한 항체반응인지...)

첫번째 lane도 다른 lane보다 진하게 나올 이유가 없는데.. (정량 및 로딩시 문제일거라 생각)

목적단백질이phosphoform이기 때문에 밴드가 잘 보이지 않았거나 모두 non specific한 band가 아닐까란 생각도 해보았고 목적 단백질이 cleavaged 되어 저렇게 밴드가 아래에 나타날 수도 있는게 아닐까 생각해보았는데 그럴 수 있는지 전혀 감이 잡히질 않습니다..

웨스턴이 처음해보는 실험이고 물어볼 사람도 없어 다른분들의 의견을 들어보고싶습니다..
#jak1
 
#phosphoform
 
#p-jak1
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리아이고야  |  02.19 18:18  

다른건 모르겠지만..포스포폼 보시려면 PBST 쓰시면 안되고 TBST 쓰셔야할거같아요!

올챙이호안미로  |  02.19 23:22  
답변 감사합니다..! 제가 잘못 기재했네요 pbst가 아니라 tbst로 사용하였습니다!
개구리닥눈삼  |  02.19 23:59  

사용하신 항체 정보가 더 있으면 좋겠네요.

어느 부위를 타겟으로 하는 항체인지 모르겠으나 예상 사이즈가 좀 크네요.

올챙이호안미로  |  02.20 01:35  
답변 감사드립니다..
실험에 사용한 셀은 raw264.7 이고 1ug/ml의 lps를 30분 처리하여 찍은 것입니다.
사용한 항체는 다음과 같습니다.

1st: p-jak1 (pa5-104554 /invitrogen)
2nd: goat-anti rabbit igG (65-6120 /invitrogen)
대왕개구리SPEED  |  02.20 11:51  

Raw cell에서 LPS 처리 후 Jak1 phosphorylation을 측정한 이유가 있나요?

LPS activation pathway와 Jak1 pathway는 다른 경로 아닌가요?

올챙이호안미로  |  02.20 19:28  
늘 답변 감사합니다.
lps처리하여 activation된 raw cell에서 jak1과 jak2의 phosphorylation이 일어나 염증반응이 유발되는 내용의 논문들을 보고 이를 참고하여 실험을 진행하였습니다.
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