1. 2cut 효율을 정제 후 확인을 반드시 해야 합니다.
2. kit를 사용하지 말고 아래 방법으로 하면 됩니다.
- 제한효소 열 불활성화
- DNA 부피에 멸균수를 300ul까지 mass-up.
- 30ul 3M NaOAc 추가
- 660ul cold 100% EtOH 추가 후 inverting, -20도 30분
- 원심분리 13krpm, 4도, 15분
- 70% EtOH 1ml washing.
- Dry, 전기영동 확인
3. kit는 사용 방법에 문제가 있을 것으로 보입니다.
실험자가 실제 진행한 protocol이 있으면 문제점을 확인해 볼수 있습니다.
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레벨2
arklion
(과기인)
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21.03.30 16:08
SPEED님 답변 감사합니다.
프로토콜은 아래와 같은데.. PCR product를 분리할 때는 크게 문제가 없었습니다. 꼭 선형화된 vector에서만 효율이 급감하더군요.. 밴드는 뚱뚱하게 잘 나왔는데..
1. Product의 5배(40 μL=200 μL)의 PB buffer와 1배(40 μL=40 μL) 의 absolute isopropanol을 넣고 vortexing 하여 섞는다.
2. Collection tube를 연결한 binding column tube에 BST solution을 100 μL 넣고, centrifugation (13,000 rpm, 30 sec) 한 뒤 eluent를 버리고1 collection tube를 다시 연결한다.
3. (1.)의 mixture를 (2.)의 binding column에 넣고 centrifugation (13,000 rpm, 1 min) 한 뒤, eluent를 버리고 collection tube를 다시 연결한다.
4. 500 μL의 W2 buffer를 넣고 centrifugation (13,000 rpm, 1 min) 한 뒤, eluent를 버리고 collection tube를 다시 연결한다. 4.을 1회 반복한다.
5. 잔여 W2 buffer 제거를 위해 (반복 후 4.) 상태 그대로 한번 더 centrifugation (13,000 rpm, 5 min) 한 뒤, 물방울이 달라붙지 않았는지 확인한다.
6. Binding column을 멸균된 1.5 mL EP tube에 연결한 뒤, 30 μL의 EA buffer를 넣고 heating block을 이용하여 60oC에서 10 분 간 방치한다.
7. Centrifugation (13,000 rpm, 1 min) 하여 DNA를 elution 한다.
8. NanoPhotometer을 이용하여 각 플라스미드 농도(A260) 및 순도(A260/A280)를 확인한다.
protocol은 크게 문제가 없어 보입니다.
1. 2번 washing 후 37도에서 dry, 10분
2. elution 부피의 1/2씩 2번 elution.
30ul elution의 경우 = 16ul X 2번
elution buffer를 넣고 37도에서 10분 후 원심분리 해보세요.
3. iPA를 넣지않고 해보세요.
이 kit는 일반적인 chaotropic salt를 넣고 direct binding시키는 type과 다른
방식이네요.
1~3번으로 개선해도 수율이 안좋으면 그냥 EtOH down해서 사용해도 되고
다른 kit를 사용해보는 것도 좋을 듯 합니다.