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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 Transformation 이후 vector의 form에 관해 질문드립니다.
알B_B_(대학생)  | 04.04 20:49

pGEM-T Easy vector에 taq pol로 증폭한 gene을 ligation 후 cp cell에 넣어서 transformation시키는 실험을 진행 중에 있습니다. 

실험 진행 후 얻은 colony를 제한효소 처리없이 cracking만 진행한 후 gel running을 해보았습니다. 그그 결과 ligation 이 되지 않은 pGEM-T Easy vector로 보이는 band와 증폭하여 넣어준 gene이 ligation되어 크기가 증가한 pGEM-T Easy vector로 보이는 band, 그리고 이 두 band말고 다른 2개의 band가 추가로 관찰 되었습니다. 

이 band가 혹시 super coiled form이 된 vector인지 궁금하여 bric에 검색도 해보고 구글링도 해보았지만 도저히 찾을 수가 없었습니다.

검색 도중에 알게된 사실은 ligation 과정자체에서는 topoisomerase가 존재하지 않기때문에 vector가 super coiled form을 형성할 수 없다는 것이였습니다.

그렇다면 혹시 ligation이후 얻어진 vector를 cp cell에 transformation한 후, 이를 배지에서 배양할 때 supercoiled form의 vector가 생길수 있는 것인지 궁금합니다. 

#transformation
 
#supercoil
 
#vector
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.04 21:13  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

GEM-T는 Topo방식이 아니라 ligase방식입니다.

TF 후 cell 내에서 당연히 CCC form을 형성합니다.

알B_B_  |  04.04 21:28  

답변 감사드립니다.

실례가 아니라면 혹시 추가적으로 답변 부탁드려도 될까요?

그럼 gel running이후에 관찰되는 band는 ccc form을 형성하는 ligation 된 vector와 /  ligation 되었지만 ccc form을 형성하지 않은 circular form vector / 넣고자 하는 gene이 ligation 되지않은 vector 이렇게 관찰 될수 있다고 보면 될까요?

대왕개구리SPEED  |  04.04 21:42  

전기영동 관련된 문제는 사진이 있어야 문제점 파악이 쉽습니다.

알B_B_  |  04.04 21:48  

upload_image

running 결과사진입니다.

대왕개구리강시  |  04.04 22:19  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
두번째, 세번째, 네번째 lane의 밴드를 보면,
맨위의 두꺼운 밴드는 gDNA입니다.
두번째 밴드는 벡터 control보다 조금 큰 plasmid 입니다.
그 아래로 23S, 16S rRNA 입니다.
벡터 콘트롤은 cracking 한 것이 아니므로 gDNA, rRNA 밴드가 없는 것입니다.
Cracking한 샘플은 cracking 한 control과 비교해야 합니다.
참고로, cracking을 하면 위에서부터 gDNA, plasmid, 23S rRNA, 16S rRNA 순으로 보이며, 짧은 시간 run 하면 맨 아래에 tRNA 가 보입니다.
대왕개구리SPEED  |  04.04 22:42  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

전기영동에 마커는 항상 같이 loading하는 것이 좋습니다.

맨 위의 band는 pGEM-T가 3kb 정도이기 떄문에 모양을 보면 gDNA같이 보이는데

위치는 아닌것 같습니다.

정상적인 plasmid prep.을 해서 제한 효소로 잘라 보세요.

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