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1. strip 전후에 sample과 HK을 각각 측정.
2. sample과 HK의 분자량이 차이가 나는경우 1장의 membrane을 잘라서 각각 측정.
3. 2장의 membrane을 동일양 loading해서 sample과 HK를 각각 측정.
위 3가지 방법이 있습니다.
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레벨3
암린이
(대학생)
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21.04.23 09:42
매번 답변달아주셔서 감사합니다 speed 선생님 ㅠㅠ!!
그렇다면 혹시 1번의 경우에는 develop을 한 membrane에
ECL만 washing 해주고 바로 1차 antibody로 housekeeping gene을 붙이고 다음과정 진행하면 되는걸까요??
stripping buffer -> PBS washing -> TBST washing -> blocking 순으로
하면 됩니다.
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레벨3
암린이
(대학생)
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21.04.23 10:05
아핫 네넵 ㅠㅠ 감사합니다..! ERK와 b-actin을 하는데 kDa가 너무 비슷해서 strip을 해도 잘 뜨지 않더라구요..ㅠㅠㅠㅠ
혹시 질문 하나만 더 해도 되나요??
cell 실험 시 n 반복 실험이라는게, 동일 sample을 3번 western blot하는건지
아니면 passage를 다르게 하여 같은 방법으로 sample을 만들어 western 하는 것을 3번 한다는건지 잘 모르겠습니다..!! ㅜㅜ
- kDa가 너무 비슷해서 strip을 해도 잘 뜨지 않더라구요.
: 분자량 문제가 아닐겁니다.
sample 만들 때 passage를 다르게 하지는 않습니다.
동일 passage에서 sample을 만들어 비교하는 것이 좋습니다.
한장에서 sample과 HK를 보는 것이 좋지만 ERK vs b-actin 분자량이 거의
같기 때문에 두장을 하거나 stripping을 하는 것이 좋을 듯 합니다.
아니면 GAPDH를 측정하면 분자량 차이가 조금 나기 때문에 한장에 항체
2개를 넣고 동시에 측정하거나 menbrane을 잘라서 측정 가능합니다.