보관 균주의 plasmid 농도는 변합니다.
fresh한 균의 plasmid 농도가 가장 높습니다.
plate에 오래 보관된 균은 항생제 액체 배양을 해도 점점 줄어 듭니다.
첨부 사진은 sol.III 처리가 잘되지 않는 것으로 보입니다.
-
레벨3
레비나스
(대학원생)
-
21.05.15 17:01
답변 감사드립니다 SPEED님 그런데 궁금한 것이 있습니다.
Sol3가 처리되지 않았다면, Sol3의 양을 더 증가시켜서 넣어야 할까요?
그리고 glycerol stock E.coli를 사용했는데도 효율이 안좋았던 거라서
stock을 새로 만들어야 할까요?
stock을 만들 때는 glycerol이 20%가 되도록 만들었습니다.
Sol.I~III비율은 정해져 있기 때문에 더 넣는 것은 안좋습니다.
다시 분리해서 동일한 현상이나오면 Sol.III를 다시 만드는 것이 좋습니다.
plasmid 분리도 실력이 필요하기 때문에 현재 수율이 낮아진것이 100%
균 문제인지는 알수가없습니다.
사진 같은 현상도 나타나고 하니 다시 분리해서 수율을 확인해 보는 것이
좋을 것 같습니다.
-
레벨3
레비나스
(대학원생)
-
21.05.15 19:13
감사합니다 SPEED님.
한번 더 해보도록 하겠습니다.
alkaline lysis 오리지날 논문을 보면, plasmid prep에 사용하는 sol I, II, III 의 양과 비율은 잘 자란 대장균 1.5ml 을 기준으로 정한 양입니다.
세균의 양이 많아지면 Sol II에 의한 cell lysis도 불완전해지고 Sol III 에 의한 neutralization 도 불완전해서 사진과 같은 현상이 일어납니다.
사진과 같은 현상은 Sol III 에 의한 neutralization이 불완전하게 일어난 현상이므로 Sol III 를 원래 넣는 양만큼 더 넣어주면 해결됩니다.
가령 Sol III 를 150ul 넣었다면 150ul 를 추가로 더 넣고 잘 섞은 후 원심분리 한 번 더 하세요. 그러면 어느정도 해결이 됩니다.
첨부터 plasmid 양을 늘일 생각으로 대장균 배양액을 많이 사용한다면 Sol I, II, III 의 비율을 1 : 2 : 2 또는 1 : 2 : 2.5 로 해 보세요.
-
레벨3
레비나스
(대학원생)
-
21.05.16 15:33
답변 감사드립니다 강시님.
mini prep kit는 qiagen kit를 사용하고 있습니다.
kit protocol에서는 P1 buffer 250ul, P2 buffer 250ul, N3 buffer 350ul인데
P2 buffer를 500ul를 넣고 N3 buffer를 700ul 정도 넣어볼까요?
(아마 다 넣으면 e-tube에 가득차거나 조금 넘칠 수도 있을 것 같습니다.
아니면 P1, P2는 그대로 하고 N3만 700ul 넣어볼까요?
감사합니다 강시님