안녕하세요? 필코리아테크놀로지입니다.

사용하신 pfu DNA polymerase가 어느 제품인지 확인이 필요합니다.

protocol에서 1분에 1kb라면 정확하게 7.5분으로 두는 것이 아니라 abortive extention도 무시하지 못하므로 좀 더 여유를 두어 1바퀴 하는 충분한 시간을 두심이 좋습니다.

primer의 조건은 서열에 따라 다른데, 디자인을 어떻게 하셨는지 정보가 없어 답변드리기 힘들며, 얼마나 상보성을 띄는지 (specificity가 높은지?)가 더 중요합니다. protocol에서 78도씨를 맞추라고 하나 그것에는 상보성을 높이기 위해 보통의 경우로 맞추기 위한 목적이 큽니다. (TMI: 제조사 입장에서 유저가 실험을 잘 이행할 수 있도록 맞춘 것: robustness가 높다고 표현합니다.)

일전에 수행할 때는 stratagene의 webpage를 통해 수행한 적이 있으며, 동일한 제품이 agilent로 합병되어 webpage를 확인해보시면 자동으로 해당 부분을 디자인 해주는 tool도 있으니 참고부탁드립니다.

그리고 SDM (site-directed mutagenesis)의 경우 transformation 효율이 중요합니다. DpnI 처리 후 잘 되지 않으면 굉장히 많은 colony가 생기고, DpnI이 처리가 잘되었으나 transformation 효율이 낮으면 0 colony일 수도 있습니다.

LB agar, DH5alpha로 진행했었습니다. 

해당 시험법보다, overlapping PCR로 해당 부분을 SDM한 후 recloning하시는 방법이 좀 더 쉽고 빠를 수 있어서.. 브릭 QnA 검색해보심이 어떠실까 합니다. (다른 ID로 답변했었습니다.)

감사합니다.

(주)필코리아테크놀로지
http://www.philekorea.co.kr/
 

1. 7.5kb에 7.5분은 조금 짧습니다.

조금 더 길게 하는 것이 좋습니다.

2. Tm 78도 이상이 아니어도 됩니다.

3. 전기영동해보니 band가 5~6kb사이에 굉장히 두껍게 나옵니다.

: 정상적인 현상은 아닙니다.

4. Host는 관계없습니다.

5. mutagenesis는 kit를 사용하는 것이 반드시 잘된다고 볼수는 없습니다.

그냥 F or R primer 중 하나에 mutation base를 넣고 PCR하면 쉽게

얻을 수 있습니다.