실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
agilent quikchange site-directed mutagenesis..
레벨1 5pqrstyou000 (대학생)
안녕하세요 현재 mutagenesis 진행 중인데
primer Tm값이 78도 이상이어야하잖아요..?
primer 서로 상보적이고 mutation 일으킬 부위를 가운데로 해서 Tm값 최대한 늘리고 늘린 게 71도 41mer입니다(mutagenesis primer Tm값 계산식 사용함).. primer 31mer로 줄이면 Tm값이 65도 정도 되는데 이럴 경우 primer가 짧은 게 낫나요 Tm값이 높은 게 낫나요?
크기는 7.5kb정도 되어 extension time을 7.5분으로 설정하고 PCR 한 후(14 cycles) 전기영동해보니 band가 5~6kb사이에 굉장히 두껍게 나옵니다. control은 밴드 하나만 제 자리에 나왔구요ㅜㅜ 이런 경우에도 mutagenesis가 잘 될 수 있을까요..? template 양은 100ng 사용하였습니다.
그리고 XL-1blue supercompetent cell 대신 dh5a사용하고, NZY+ broth도 없어서 그냥 LB하려 하는데 프로코콜은 dh5a로 트폼 시 사용하는 프로토콜로 진행하면 되겠죠..?
여러가지 조언 부탁드립니다........
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