우선 답변을 하기 전에 수정할 내용 하나에 대해 말씀드리자면, 'D10A가 mutation이된 dCas9 벡터'는 약간 틀린 말일 수 있습니다. 보통 dCas9은 D10A와 함께 H840A mutation도 같이 있어야 dCas9이라고 말하고, D10A와 H840A 중에 한개의 mutation만 존재하면 Cas9 nickase라고 부릅니다.

1. dCas9에 gRNA가 붙게 되면 target site에 binding은 하지만 cleavage는 일어나지 않는 상태로 존재하게 됩니다. 이 때 dCas9에 Fok1이 linker로 연결되어있게 되면, dCas9용 gRNA로 targeting한 부위의 주변에서만 cleavage가 일어날 수 있도록 만들 수 있지요.

dCas9-Fok1을 이용해서 specificity를 높이고 싶으면 두번째 논문 Fig 1a 방식을 사용하면 됩니다. 2개의 Fok1이 homodimer를 이루어야만 nuclease activity를 가지도록 design을 하고, 2개의 gRNA를 target부위의 "매우 근처"를 인식하도록 만들게되면 specificity를 높일 수 있을겁니다.

2. 2개의 gRNA를 design을 했으면, 2개 중에 1개만 먹힐수도 있고, 2개 다 작동할 수도 있고....이론상으로는 2개가 동시에 working시키면서 editing 효율을 높이는 식으로 생각할 수 있습니다.

3. 이 질문은 논문의 몇번 Figure에 대한 내용인지 추가 내용이 있었으면 좋겠습니다.

저번에도 답변해주시고 정말 도움많이됐어요. 감사합니다!

Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes

위 논문에 벡터 입니다. 

pX330A_Fokl-1x2 vector는 fok1-dCas9라는 특징을 가지고 있지만

pX330S-2 vector는 Cas9이 붙어 있는데 이 벡터를 사용하는 이유가 궁금합니다. 

pX330A_Fok1 vector와 pX330S-2 vector는 모두 그림 가장 아래에 있는 "Fok1-dCas9 단백질 및 2~7개의 gRNA에 대한 서열을 모두 가지고 있는 vector"를 만들기 위한 재료들입니다.

Restriction enzyme에 의하 cleavage가 일어나는 부위(그림에서 노란색 선으로 표시된 부위)가 vector의 어디에 위치하는지 살펴보시기 바랍니다.

pX330A_Fok1 vector의 경우 gRNA 서열과 Fok1-dCas9 서열의 사이에 위치하는 반면, pX330S의 경우 gRNA 서열의 5'/3' end의 바깥에 각각 위치합니다.

pX330S vector의 경우 결국 온전한 gRNA 서열이 cleavage가 되어서 나오게 됩니다(그림에서 Insert라고 적힌 part). pX330A_Fok1의 cleavage site를 보면 비어있는 부분이 있네요(Vector라고 적힌 그림). 그 빈 자리에 insert가 들어가서 우리가 실험에 사용하고자 하는 vector를 만들게 됩니다.

즉, Cas9 vector의 사용 목적은 gRNA 서열을 cleavage하기 위한 재료 vector일 뿐, Cas9 protein을 사용하고자 하는 것은 아닙니다.

정말 감사합니다 도움 많이 됐습니다!!