실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Small RNA Analysis
miRNA mimic transfection 후 RNA 농도가 너무 낮습니다.
레벨1 행인2 (대학원생)
안녕하세요~ miRNA mimic으로 transfection을 통해 qrt-PCR로 발현확인 후,다른 protein과의 발현여부를 확인하고 있습니다.
transfection 전 mi rna 추출과정에서, nano drop으로 측정한 rna 순도가 지금까지 한 실험 중 가장 높은 농도는 7~80ng이었습니다.
지금까지 반복실험을 4번정도 진행하였는데 평균적으로 50정도됩니다.
RNA 농도를 더 높여보려고 pellet양을 늘리는 방향으로 진행중인데,
혹시 transfection농도가 잘못되었거나, 다른 이유로 인해 RNA 농도가 매번 적게 나오는 건지 고민입니다.
보통 1000으로 나눠주는반면, 200-500으로 값을 계산해준뒤 희석하여 사용하였습니다.
Transfection 조건은 이러합니다.
60파이 plate
Media 2ml
miRNA mimics 20nM로 희석해준 용액에서 3.75 마이크로리터 따서 R buffer와 희석.
(37.5nM(저희실험실에서 일반적으로 계산해서 하는 효율적인 Transfection농도))
cell 양은 1.5*10^6 이나, 1*10^6으로 transfection 진행하였습니다.
현미경으로 본 cell 수는 거의 90퍼센트 정도되었는데, 막상 pellet을 모아보니 다른 cell에 비해
확실히 적은 느낌이 듭니다. MCF7 자체가 그런건가요 ?
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