- PAGE를 사용한 목적이 정확히 뭔가요?
- ligation 시키기 전 시료는 전기영동 안했나요?
ligation 전 시료를 봐야지 원인 파악이 가능할 것 같습니다.
- 전기영동 자체는 문제가 없고 농도 문제도 아닙니다.
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레벨1
Cyl07
(대학생)
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21.10.14 13:14
SPEED님 답변 감사합니다.
- PAGE를 사용한 목적이 정확히 뭔가요?
실험에 대해 조언을 들을 때 PAGE로 진행해야 더 명확한 band가 나올 수 있으니 page로 진행하라는 말을 들어 DNA PAGE로 하게 되었습니다.
- ligation 시키기 전 시료는 전기영동 안했나요?
제가 사진에 대한 추가적 설명이 부족했습니다.. 1차 DNA PAGE 사진에서 제일 왼쪽의 LADDER 기준으로 3번 째 칸이 ligation시키기 전의 linear DNA를 loading 시킨 위치입니다. linear DNA는 100uM농도였기에 linear DNA를 0.5ul, nfw를 9.5ul 섞은후 6x loading dye 2ul를 섞어 loading시켰습니다. 그런데 band가 문제가 아니라 일단 희미하게 나타났습니다.. 그리고 전체적으로 시료들은 분리되어 band가 나타나지않고 마치 페인트칠하듯 쭉 일자로 내려왔습니다.
이후 농도가 문제라고 생각했었기에 다시 ligation한 시료들을 nanodrop으로 OD값을 측정한 후 이에 맞춰 2차 DNA PAGE로 농도에 따라 대략적으로 희석을 시켜서 진행했는데도 변하지 않아 무엇이 원인인지 궁금했습니다.
- 이정도 실험은 agarose gel에서도 정확히 확인 가능합니다.
- vector 1개만 self ligation한건가요?
- nfw가 멸균 증류수인가요?
- ligation은 어떻게 했나요?
- vector 위의 band는 사진처럼 나올수 있는데 아래쪽은 분해되지 않으면
나올수 없는 pattern인것 같습니다.
뭔가 ligation할 때 문제가 있는 것 같습니다.
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레벨1
Cyl07
(대학생)
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21.10.14 13:47
SPEED님 답변 감사드립니다.
- vector 1개만 self ligation한건가요?
Linear DNA 2종류 (Long DNA, Short DNA)를 이용해 Ligation 진행했습니다.
- nfw가 멸균 증류수인가요?
증류수에는 DNase가 있을 수 있어 희석 시 DNA가 분해되지않기 위해 사용했는데 nfw가 멸균 증류수인지는 고려치 않았습니다.
- ligation은 어떻게 했나요?
Ligation 결과물을 총 20ul가 나오게끔 설정을 했는데, Long DNA와 Short DNA의 비율을 각각 1:1, 1:2, 1:4 비율이며 동시에 final concentration이 10uM이 되게끔 설정했습니다. 따라서 long DNA는 2ul씩, short DNA는 비율에 따라 2ul, 4ul, 8ul를 넣고 모두 T4 ligase를 1ul씩, T4 ligase buffer는 2ul씩 넣었습니다. 이후 나머지는 nfw로 채웠습니다.
2개의 방법을 이용했는데 첫 번째는 25도에서 2시간 기다린 후 65도에서 10분간 대기시켜주었고 2번째는 16도에서 overnight 후 65도에서 10분 대기시킨 후 loading 시켰습니다.
Agarose로도 실험을 진행해 볼 예정인데 혹시 page로는 힘든걸까요..? 그리고 농도가 문제가 아니라면, 시료를 loading 시 희석을 시킬 필요가 없는 건가요?
- 제가 사진에 대한 추가적 설명이 부족했습니다.. 1차 DNA PAGE 사진에서
제일 왼쪽의 LADDER 기준으로 3번 째 칸이 ligation시키기 전의 linear
DNA를 loading 시킨 위치입니다.
: ligation 전 시료의 전기영동이 있다고 했는데 long, short DNA 전기영동이
안보입니다.
1차 3번째 lane에는 band가 1개 만 보입니다.
- ligation 후 65도에서 반응한 이유는 뭔가요?
- PAGE도 되고 agarose 전기영동 또한 가능 합니다.
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레벨1
Cyl07
(대학생)
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21.10.14 14:08
- ligation 전 시료의 전기영동이 있다고 했는데 long, short DNA 전기영동이
안보입니다. 1차 3번째 lane에는 band가 1개 만 보입니다.
죄송합니다. 4번째 lane을 말씀드리는데 잘못 말씀드렸습니다..!
- ligation 후 65도에서 반응한 이유는 뭔가요?
주문했을 때 받은 protocol 종이에서
Heat inactivate at 65°C for 10 minutes. 라고 쓰여있어 그대로 따랐습니다.
- PAGE도 되고 agarose 전기영동 또한 가능 합니다.
전기영동을 한다면 linear DNA의 bp가 대략 60정도였는데 3% agarose gel로 하면 괜찮을까요?
- heat inactivation은 하지 않아도 됩니다.
- 1차 4번 lane에 DNA가 안보입니다.
- 2개 DNA 크기가 어떻게 되나요?