- lysis buffer는 100ul를 사용하는 것이 좋을 듯 합니다.

 

- sonicator 장비명이 어떻게 되나요?

 

- RIPA만 사용해도 100% lysis 가능합니다.

 

- cell을 떼어낸 후 tube에 옮길 때 loss가 많이 나오나요?

 

- 나머지 과정은 별 문제가 없어보이며 lysis 단계는 상당히 간단한

과정입니다.

 

근데 단백질 정량하시는방법이 그냥 흡광도 재서 10곱하나요? standard curve같은거 안만드시나용

답변 주셔서 감사드립니다

Sonicator 장비명은 Qsonica, US/Q700, 700W
입니다

1ml tip으로 옮기는 데 쭈욱 빨아들이고 나면 1ml tip 위쪽에 옅은 하얗색으로 부유물들이 붙어 있더라구요 처음에는 메탈렉위에서 하다보니 온도차에 의해서 김이 낀 줄 알았는데 물로 씻어보니까 dish에서 cell 긁었을 때 나오는 하얀 부유물인 것 같아서 loss가 생기는 것 같다고 말씀드린 거예욥ㅠㅠ

Standard curve는 bradford 제품 설명서에 나와있는 표준곡선 기준으로 간략하게 재는 거 같더라구요(첨부파일에 있습니다.)
저희 랩에서 스탠다드 curve그려서 정량 하는 것은 보지를 못했습니다

정말 제가 있는 문제의 답을 얼른 찾고 싶네요. 불쌍한 초보 석사를 도와주셔서 감사합니다ㅠ

1well기준 농도가 어느정도로 나오시는건지??

일단 그렇게 standard 를 기존에 나온걸 이용해 하시는건 잘못된 방법입니다.

매번 스탠다드를 그리셔야합니다.

그리고 PBS 워시하고 플레이트에 바로 RIPA 넣어서 해보시는 것도 방법일거예요 저는 이렇게 하는데 별 문제 없이 되요

- 일단 정확한 정량이 아닌 현재 lab에서의 방법으로 다른 사람들 보다

흡광도가 적게 나오기 때문에 수율이 낮은 것은 맞는것 같습니다.

 

- 단백질 정량 방법에서 OD만 가지고 mg/ml을 절대 구할 수 없습니다.

 

- 단백질 정량 assay할 때는 STD를 적어도 3 point를 측정해서 mg/ml을 한

다음 실험하는 것이 좋습니다. 

1. 35ml 60ml 100ml dish가 아니고 35mm 60mm 100mm dish 입니다.
읽을 때는 편의를 위해 35파이 60파이 100파이 디쉬라고 읽기도 합니다.

2. cell detach 시에 Trypsin-EDTA를 사용하면 cell loss를 줄일 수 있습니다.
(cell scapper 사용이 미숙하다면 이 step에서 cell이 많이 터집니다. wash를 위해 cell down 및 버퍼 교환을 한다면 터진 cell에서 나온 단백질들은 모두 사라지게 됩니다. 아마도 질문자께서 다른 연구원들과 수득률에서 차이를 보이는 이유는 이 부분이 원인이 아닐까 생각됩니다.)

3. RIPA buffer는 구글 대충 찾아보니 (1 ml per 0.5 to 5 × 10^7 cells) 으로 사용한다고 하니 질문자께서 사용한 양이 문제가 되지는 않을 것 같습니다. (cell lysis는 RIPA buffer로 충분하며 추가적인 sonication은 필요 없을 것 같습니다. 차후에 하고 안 하고의 차이를 비교해보세요.)

4. protein은 상온에서 실험할 땐 계속 ice에 박아둡니다. 따라서 ice incubation은 그저 'ice에 놓고 실험해라' 정도로 이해하시면 됩니다. 굳이 찝찝하니 해야겠다고 한다면 5분도 상당히 충분한 시간입니다.

5. bradford 정량 시, 매 분석마다 standard curve를 만들어야 합니다. 이건 bradford 뿐만 아니라 모든 정량법에 있어서 기본입니다. 5번 정도는 serial dilution하여 standard solution을 만드시길 추천드립니다.

6. bradford에서 detergent가 문제가 될 것이라고 예상한다면, bradford 용액에 detergent만 넣고 흡광도를 쟀을 때의 변화를 비교해보면 됩니다. 차이가 두드러지게 나타난다면 standard solution에 동일한 양의 detergent를 넣어 standard solution을 만들어야 합니다. 다만 경험적으로 봤을 때 크게 문제는 되지 않을 것으로 예상합니다.

6. bradford로 나온 흡광도를 standard curve에 대입시켜 농도를 계산해야 합니다. 그 자체로 농도를 나타내지는 않습니다.

7. 정량 없이 단백질의 유무만을 확인하고 싶다면, harvest한 cell에 바로 SDS sample buffer를 넣어 끓이고 centrifuge를 통해 cell debris 정도만 제거하여 loading해도 됩니다.

친절한 답변 감사합니다
앞으로는 매번 standard curve를 그려서 해야겠네요
Scraper 사용에 대해서 다시 한번 살펴봐야 갰네요
100ml dish harvest할 때는 trypsin을 쓰기도 했는데 30ml dish를 trypsin으로 뗀다면 얼마나 넣고 처리하는 게 좋을까요?

우선 Standard 측정은 할 때마다 항상 해야합니다. 

Standard용 BSA 4도에 장기보존 가능합니다.

그리고 육안봤을 때도 bradford 할 때 전혀 색변화가 없던가요?

 

일단 제가 생각하기에 가능성 있는 원인은

1. RIPA buffer 제조실수

-> 랩선배 RIPA buffer를 빌려서 해본다

2. sonication

-> sonication만 생략했을 때 bradford 결과가 어떻게 나오는지 확인, 볼륨을 200ul으로 늘려주면 sonication 하지 않아도 그렇게 끈적거리지 않을 겁니다

 

 

 

트립신은 면적 대비 계산하셔서 사용하시면 됩니다.

100파이 디쉬는 5x5x3.14 cm2 정도 될테고

35파이 디쉬는 1.75x1.75x3.14 cm2 정도 될테니

넣던 볼륨의 1/8 정도 넣으면 되지 않을까 싶네요.

랩 선배꺼 RIPA를 써도 비슷한 양상을 보여서 buffer 문제는 아니라고 생각했습니다

bradford 넣었을 때 buffer만 넣은 control과 비교하면 육안으로 보기에 색변화가 거의 없었습니다

저는 sonication 없이 볼텍싱, 손톱으로 탭핑만 해주는데도 괜찮더라구요. 그정도 RT 가는건 별 문제 안됩니다. 저의 경우에는 아이스에서 10분 인큐베이션 해주면서 2-3분에 한번씩 볼텍싱 10~20초씩 해주고 손톱으로 탭핑하고 꽂아두는식으로 합니다.

 

vortexing 이 필요한것 같습니다. RIPA lysis 효율이 생각보다 차이가 나더라구요. 온도는 크게 걱정 안하셔도됩니다. 무리해서 몇분씩 vortexing할 필요는 없고 30초~1분정도만 하셔도 protein 변성 문제는 크게 없을겁니다. 그리고 protease inhibitor를 넣으시니까 incubation 시간도 30분정도면 무리없을겁니다. 좋은 결과 내시길!

lysis 할 때 lysis buffer volume을 1ml에서 200~400ul로 줄이시고 최대한 Loss 없이 하시면 될듯합니다.

buffer의 양이 너무 많아서 단백질이 희석되는 것 같습니다.

예전에 RIPA buffer를 구매해서 사용해본 적이 있는데 lysis가 잘 되지 않았던 경험이 있습니다. 이후로 Triton X-100가 함유된 lysis buffer를 직접 만들어서 사용하는데 지금까지 lysis에 문제가 된 적은 없습니다. 가능하면 다른 종류의 lysis buffer를 사용해보는 것을 추천합니다.

원인이 다양한데

대강 포인트만 잡자면

1. confluency 확인

2. 셀 펠렛 양 확인 (대충 스핀다운 후 펠렛 양보면 단백질 농도 나옵니다)

3. 정량시 사용한 스탠다드 및 계산 확인 (스탠다드 커브는 매번 그리셔야합니다)

 이쯤하면 뭐가 문젠지는 나올거같내요