실험 Q&A Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
Cell lysis 관련해서 고생하는 초보대학원생 입니다. 전문가 분들의 의견 부탁드립니다
레벨1 cell실험입문석사 (대학원생)
안녕하세요. cell 실험을 하고 있는 대학원생입니다. cell lysis를 진행하고 나서 bradford assay로 정령 한 후에 protein 농도가 계속 낮게 나오는 데 여러가지 조건을 바꿔가면서 해도 아직까지 헤메고 있는 중이네요ㅠ 실험실에 있는 선배 분들이 주는 조언대로 이것저것 시도해보고 있는데 자꾸 원하는 결과가 나오지 않아 웨스턴 블랏 실험을 진행하지 못하고 있어서 답답한 실정입니다 키우는 cell은 U2OS입니다 (연구실 선배들은 HeLa와 비슷하게 생각하면 된다고 하더군요) 저희 연구실에서 대부분 쓰고 있는 100%cell confluecy는 35ml 기준 0.8 x10^6 60ml dish 기준 1.6x10^6 100ml dish 기준 4.8x10^6 (Culture dish는 SPL사꺼 쓰고 있습니다) 우선 cell은 RIPA buffer로 깨고 있습니다 RIPA buffer는 2X stock을 만들어 lysis 시 D.W와 inhibitor를 처리하여 dilution 후 사용 중입니다 (이것도 문제나 되나 싶어 의문이 들더라구요ㅠ) 2X 조성은 100mM Tris-cl(pH 7.5) 300mM NaCl 2% NP40 1% SDC 0.2% SDS 이고 여기에 NaF 5mM NaV 100uM EDTA 2mM PMSF 1mM Protease cocktail 1X 넣고 쓰고 있습니다 35ml dish(또는 60ml dish)에 40%-50% confluency로 cell seeding 해서 키우고transfection 후 24h(또는 36h) 후에 harvest 하여 lysis 합니다 혹시나 cell이 적은 것 아닌가 하여 harvest 하기 전에 dish를 현미경으로 보면 꽉 차 있습니다 lysis 과정은 1)우선 dish에서 배지 제거 2)PBS로 wash 후 pbs 넣기 3)cell scraper로 dish를 긁은 후에 1ml pipette으로 e-tube에 옮겨담기 -> 이 때 tip을 보니까 tip벽에도 cell이 붙어서 loss가 생기는 것 같기도 하더라구요 tip에 안 붙게 하는 방법을 찾아도 안나오고 다들 별 신경안쓰고 하는데 저만 안 되니까 이런 부분도 생각을 하게 되었습니다그렇다고 이 loss가 단잭질이 안 나올만큼 인지도 모르겠습니다ㅠㅠ 4) 2000rpm, 4℃, 5min swing rotor centrifuge 돌려서 pellet 만들고 상층액 pbs 제거합니다 -앞 단계에서 배지 제거 후에 pbs wash를 안하고 pbs 넣은 상태에서 cell을 긁은 적도 있는데 이 때는 pbs를 pellet까지 다 제거하지 않고 약간 남겨서 pellet을 200ul pipette으로 resuspension한 후e-tube에 pbs 채워서 4) 조건과 동알하게 centrifuge 돌립니다 5)그리고 pellet에 RIPA buffer를 넣고 pipetting을 30-50회 정도 하여 pellet을 풀어줍니다 -> 여기서도 헷갈리는 게 저희 연구실은 35ml 꽉 찬 dish를 RIPA 30-50ul를 넣고 깨더라구요 구글 서치를 해보고 다른 분들 이야기 들어보니까 35ml dish 깨는데 100ul정도를 넣고 깬다고 들 하긴 하던데 뭐가 맞는 건지 잘 모르겠더라구요 어쨌든 RIPA를 50ul 넣는다고 lysis가 안될 꺼 같지는 않고 오히려 단백질 농도가 더 높게 나오겠지 싶어 일단 50-80ul 사이에서 저는 진행을 합니다 ->그리고 어떤 분들은 RIPA를 dish에 뿌리고 scraper로 긁어준다고도 하는데 저는 그렇게 안해보기는 했는데 그렇게 하는 것이 더 좋은 방법인건가 궁금합니다 6)pipetting 한 lysate를 ice에서 5분-30분 incubation을 합니다 ->처음에는 5분 했다가 단백질 농도가 안 나온다고 실험실 선배께 말씀 그렸더니 5분->10분->20분->30분까지 올린 건데(구글에 찾아보니 30분까지 하는 경우도 있긴하던데 이게 일반적인 것인지는 잘 모르겠습니다) 단백질 정량 후에 별 차이가 없어서 어떻게 하는 게 좋을지 잘 모르겠습니다 너무 오래하는 걸로 조건을 잡으면 protein degradation이 일어나거나 하지 않을까 싶어서 염려되기도 하여 고민이 됩니다 -> 그리고 어떤 글을 읽어보니 incubation 하면서 voltex를 해준다는 말도 있는데 voltex를 하려면 아이스에서 상온으로 온도변화가 생기는 데 이게 필요한 걸까요ㅠ 7)sonication을 진행을 합니다 저희랩에서 쓰는 sonicator는 tip을 쓰지 않고 얼음물에 e-tube를 담가놓으면 아래쪽에서 초음파가 나와 sonication이 되는 장비입니다 저희 랩에서 쓰던 조건은 Amp 80 pulse-on 10sec pulse-off 10sec Total time 2:00(12번 정도 sonication 해주는 것) 인데 혹시 sonication 때문인가 싶어서 구글 찾아보니 Amp 60 pulse-on 15sec pulse-off 45sec Total time 30sec(2번 sonication) 정도로 하면 괜찮다는 이야기를 들어서 이렇게 바꿔보고 실험도 진행해 봤습니다 근데 이것도 단백질 양에는 별 차이가 없더라구요ㅠ 8) 13,000rpm, 4℃. 10min fixed angle centrifuge 돌리고 상층액 따서 bradford 정량 합니다 9) bradford 정량 -> 처음엔 제가 RIPA를 쓰니까 detergent가 들어가서 정량이 잘 안되는 문제인가 싶었는데 실제로 저희 연구실에서는 1/10 dilution 해서 흡광도를 측정하는 거라 이게 큰 문제가 되는지 싶더라구요 -> Bio-rad사 protein assay bradford 용액을 쓰는데 저희랩에서는 1ml bradford 용액에 lysate 20ul 넣으면 완전 정확한 것은 아니지만 흡광도가 단백질 농도와 거의 같은 값으로 나와 실험실 다른 분들은 평시에 1/10 양으로 2ul 따서 측정을 합니다( 저는 detergent 고려해서 희석해서 3ul+D.W 27ul 넣고 섞어 준 뒤 20ul를 넣고 측정 합니다) -> 그래서 실험실 선배들 이야기 들어보면 50ul 넣고 깼을 때 흡광도 0.3 나온다고들 하더라구요(0.3x 10=3mg/ml) 저는 그것에도 훨씬 못 미친 0.05-0.1이 나오는 상황 입니다 -> 제가 교수님께도 지적받는 부분이기도 하고 구글에 찾아봐면 35ml dish 깨면 300ug 정도 extract가 나온다고 하는데 그러면 100ul volume의 lysis buffer에 깨도 저희 랩에서 사용하는 방법 대로하면 흡광도가 0.3 정도 나오는 게 맞는 거 같은데 아닐까요?ㅠㅠ -> 제가 얻는 흡광도를 기준으로 20ug loading 했는데 western bnad도 안나옵니다ㅠ 너무 답답한데 실험실 분들도 명쾌한 답을 주지 못해 브릭에 질문드리게 되었습니다 실험 과정에서 제가 놓치고 있는 부분이 무엇인지 전문가 분들의 성심있는 조언 부탁드립니다 초짜 대학원생 구제 부탁드립니다ㅠ
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