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질문 Mouse brain cryosection 하시는 분들께 질문드립니다..
개구리토라(대학원생)  | 2021.11.19 15:20

질문을 말씀드리자면

저희 실험실은 35um 두께로 Whole brain coronal section을 합니다.

대부분의 조직을 염색해서 다 관찰해야해서 다 잘라서 씁니다.

근데 간혹 Midbrain에서 Substantia Nigra있는 부분, Hippocampus가

아래쪽까지 커져가면서 Cortex가 다시 좌우반구 쪼개지는 부위부터는

OCT compound를 Brain 전체를 덮다시피 듬뿍발라도 Cortex와 Hippocampus가 달려있는 부위가자르다보면 흔들흔들거리다가

어느순간 통째로 떨어질때가 많습니다. 

왜이럴까요...? 

 

프로토콜은 심장에 주삿바늘 꽂은 후 우심방을 잘라서 PBS로 perfusion하고,

4% Paraformaldehyde로 3분간 흘려서 Fixation 한 후에,

Brain을 꺼내서 하루정도 더 4% Para에 담가놓고 30% Sucrose에 옮기면

완전히 가라앉을때까지 3~4일 걸립니다.

Cerebellum쪽은 잘 안써서 끝부분을 평평하게 자른 후

이를 OCT compound로 Jar에 올려서 -24도에서 얼린 후, -70도에서

꽁꽁 30분~1시간 정도 얼린 후에 꺼내서 자르는 식으로 사용합니다.

 

비슷한 현상을 겪는 분들 중 해결하신분이 계시면

답변주시면 감사하겠습니다 ㅠ.ㅠ

#Mouse brain
 
#Cryosection
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
레몬민트  |  2021.11.19   

칼날을 새 걸 써보셨는데도 떨어져나오는건가요? 칼날을 생각보다 자주 갈아주었던 것 같습니다.

depth를 더 얇게 해보세요. 너무 두꺼워서일수도 있습니다.

OCT 넣고 액체질소에서 급냉시킨 후 deep freezer에 보관해보시고, overnight 얼린 후에 사용해보세요. OCT가 안쪽이 덜 얼기도 해서 overnight으로 확실하게 냉동 후에 사용했던 기억이 있습니다.

너무 오래 전 일이라 기억이 왜곡됐을 수도 있습니다. 감안하시고 생각해보세요.

 

개구리토라  |  2021.11.19   

음, 칼날은 한번 쓰면 여댓마리씩 씁니다.

섹션할때 조직에 쭉 끄여질정도로 눈에 보일만큼의 상처가 나타나지않으면

왠만하면 계속 쓰고 있습니다.. 말씀해주신데로 당장은 데이터 쌓여있는게 있어서 당장 프로토콜을 얇은 두께로 바꾸긴 어려우나, 먼저 자르기 전 날에 얼려가지고 평소보다 deep freezer에 두는 시간을 좀 더 늘려보도록 하겠습니다. 

 

최대 두시간까진 얼려봤는데 그래도 떨어질놈은 떨어지고 붙을놈은 붙어있어서, 더 시간을 늘려봐야겠네요. 그래도 떨어진다면 두께를 얇게 해보도록 하겠습니다. 20까진 해봤는데 그 밑으로는 잘 찢어져서 시도해본적은 없습니다..ㅠ

뒷다리BU  |  2021.11.24   

시편의 준비를 연습용으로 하시네요. 실전용이 아니고.

 

연습용: 드라이아이스 위 (-70C)에서 얼림.

실전용: 수술용 사각 금속 캐니스터안에 드라이아이스를 정렬 시켜서 채움 (밀도 있게 - 가운데 몰드 놓을 자리 빼고). 아이소펜테인 액체를 뿌려서 연기가 나오게끔하여 급속 냉각 온도로 더 떨어뜨림. 아이소펜테인과 드라이아이스가 만나면 섭씨 -170이 됨. (거의 리키드 나이트로진에 맞먹는...급속 냉각 완료).

 

몰드에 오씨티를 부은다 (상온). 조심스럽게 오씨티가 들은 몰드 (시편/브레인 포함)를 실전용 냉각 캐니스터에 넣고 뚜겅을 살포시 올려 놓는다. 금방 냉각 됨.

 

다 좋은데, 결국 브레인이 이상하게 잘려 나간다는 것, 원하지 않게 떨어진다는 것은 "insufficient cryoprotection"이라는 이야기 이니까,

1. 수크로즈를 30% 말고 아래와 같이 그래주얼리 한다.

2. PBS wash via intracrdial perfusion

- 4% PFA in PBS/TBS wash via intracardial perfusion

- soak the brain in 4% PFA in PBS/TBS in a 50 ml or 15 ml conical tube at 4 C (1d)

- wash with PBS

- Soak the brain in 15 % sucrose in PBS or TBS overnight at  4C

- Aspirate out the solution.

- Soak the brain in 30% sucrose in PBS or TBS for 3-4 days at 4 C until sunk down

3. Collect the whole brain in a 24-well floating manner

( add 1 ml PBS with 0.1% sodium azide per each well)

dd  |  2021.11.24    

35um로 자르신다는걸 보면, 잘라서 바로 슬라이드에 붙이지않고 floating section을 하시는 것 같은데 

Hippocampus가 길어지면서 mid brain의 양쪽을 전부 덮는 형태가 되기때문에 플로팅으로 자르시면 워싱하시다보면 그 부분은 떨어질 수 밖에 없습니다. 

플로팅으로 염색 후 슬라이드 붙일 때 잘 맞춰서 붙이시면되요.

좌우가 달라서 구멍 뚫어서 구분하시는경우엔 뒤쪽 brain은 mid brain이랑 cortex/hippocampus 부분 각각 구멍 뚫어주셔야합니다.

만약 반드시 구멍없이 whole brain의 모습을 보셔야한다면 섹션하면서 바로 코팅슬라이드에 붙이시거나 파라핀섹션을 하시면 됩니다.

그리고 추가로, OCT에 마운팅할때 얼리기전에 4도 라커에서 30분정도 돌리면 OCT가 조직 사이 빈 공간으로 더 잘 침투해서 구멍나거나 떨어지는것을 좀 줄여주긴합니다. 

얼리는 온도도 저희랩에선 바로 -70도로 얼리는게 손상을 막는방법이라고 배웠는데, 사실 이건 뭐가 맞는지 저도 잘 모르겠어요... 

개구리토라  |  2021.11.26   

BU님 답글에 대한 답변

// 상세한 답변 감사합니다. 많은 논문에서도 Gradient하게 설탕물에

담가두는 법은 많이 봤는데, 냉동시간을 늘려도 문제가 생긴다면 변경해보도록 하겠습니다. 또한 캐너스티안? 금속? 이건 처음 배울때는 갖고있지않다가, 최근들어 다른 선생님께서 거의 10um? 6um 수준으로 얇게 심장등의 조직을 자르기 위해서 구매하셔서, 얼린 후에 썰자말자 바로 Slide glass에 붙이시기 위해 사용하려고 구매는 하셨습니다. Brain은 아무래도 크기가 크기인지라 구매한 금속 틀에 완전히 잠가지지도않는데, 별도의 다른 사이즈가 있다면 OCT 컴파운드가 낭비되지않게 브레인에 맞게 딱 좁고 긴 사이즈가 있다면 구매해보겠습니다.팁 감사합니다.

그리고, 저희 실험실 옆팀에서 동물실험을 처음부터 하고 있었기때문에 거기 박사님으로부터 배웠었는데 처음부터 소뇌의 일부를 잘라낸 후, 세워서 Cryocut 기계에 꽂아넣는 틀 위에 올려놓고 OCT 컴파운드를 뿌려서 얼린 후 진행하는 방식을 다른실험실 또한 그렇게 쓰고있었기 때문에 저는 이렇게 자르는 방식이 당연한줄 알았네요... 한번 알아보도록하겠습니다. 감사합니다

 

개구리토라  |  2021.11.26   

dd님 답글에 대한 답변 //

 

안녕하세요. 일단 말씀하신데로 floating section을 진행 중에 있습니다.

평시에는 Hippocampus가 midbrain을 감싸는 부위가 잘 안떨어지고

딱 달라붙어있는 경우가 많고, 이를 Tissue-store solution(글리세롤, 에틸렌글리콜 등)에 담군 후에 이를 건져내서 워시하는 동안에 많이 떨어집니다.

심각하게 찢어지지않는 이상 얼추 모양맞춰서 조립하면서 쓰고있긴합니다.

OCT컴파운드를 소뇌쪽에 세우는 부분에만 발라서 붙일때도 있고, 브레인 전체에 다 부어서 잔뜩 묻힌 후에 통째로 굳혀서 붙이는 경우도 있는데 붙어있을 애는 붙어있고 잘 떨어지는 애는...그냥 뭘해도 흔들거리다 cortex - hippocampus 조직통째로 잘 떨어지는거같습니다..  ㅠ.ㅠ...

일단 다들 답변해주신데로 정리해서 최적화해서 재셋팅해보도록 하겠습니다.

 

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