site-directed mutagenesis를 처음 공부하면서 실험을 하려고 하는 대학원생입니다.

제가 지금 하고자 하는 것이

플라스미드 벡터안에 있는 GGG  서열을 TGT 부분으로 바꾸려고 합니다.

<기존 서열>

..........CCTACACGCACACACACGGGCGCGCGGGCGCGCACGCACA .........

<원하는 서열>

..........CCTACACGCACACACACTGTCGCGCGGGCGCGCACGCACA............

그래서 프라이머 디자인을 이렇게 짜 보았습니다.

           S:  5’   C ACG CAC ACA CAC TGT CGC GCG GGC GCG C      3’

          AS:  5’   G CGC GCC CGC GCG ACA GTG TGT GTG CGT G      3’

Tm 값을 0.41 X 73 - 675/L + 81.5로 이렇게 계산하니까 89.49가 나오더라구요

GC content는 76% 입니다.

1. Tm 값이 78이상이긴 한데 GC서열이 너무 많아서 이렇게 프라이머를 짜도 과연 괜찮을지 의문이 들었습니다.

2. 그리고 1번의 질문과 상관없이 하나의 돌연변이 말고 2개씩 이렇게 mutagenesis 시켜도 가능한지 묻고싶습니다.

3. 그리고 혹시 site directed mutagenesis로 이 서열을 mutation 시키기 어렵다면 혹시 다른 실험으로 mutation 시키는 방법이 있는지 알고싶습니다.