- 항생제는 어떤것을 사용하나요?

 

- CP cell은 문제 없나요?

 

- empty vector만 TF하면 어떻게 나오나요?

- 항생제는 Kanamycin 사용하고 있습니다.

- competent cell의 효율을 판단하기 위해서, insert가 들어가지 않은 empty vector로 확인해본 결과 또한 콜로니가 생성되지 않았습니다.이때의 실험 조건은 컴셀 100 μL + DNA 10μL (100 ng) 입니다.

 

제가 BL21(DE3)로의 transformation을 아무것도 모른 상태에서 처음 해보았을 때, DNA를 10 μL(600 ng)을 넣었을 땐 콜로니가 나왔었거든요 ㅜ

그런데 다른 실험 프로토콜을 참고해도 600 ng 까진 넣지 않길래 줄여보았더니 콜로니가 뜨지 않는 상황이며, 주변에서도 DNA의 양이 너무 많다고 하시길래 계속해서 재 실험을 하고 있습니다..ㅜㅜ

- CP cell이 문제인것 같으니 다시 구매 또는 제조해서 사용하는 것이 좋을

듯 합니다.

 

- TF는 10ng 이하를 해도 colony가 잘 나오는 것이  정상입니다.

BL21이 문제네요

저희는 아무리 퀄이 구린 플라스미드여도

잘만 들어가던데.. 심지어 BL21이면 단백질 정제하려고 쓰시는걸텐데

DH5A에 넣은거는 이미 클로닝이 제대로 완료된 애를 넣으셨을테니

Plasmid가 문제될 확률은 적어보이고, empty vector도 안 자라면

그건 BL21 상태가 문제죠..

컴셀 문제인듯해요. 저희도 윗분 말씀대로 진짜 구린 플라스미드 가지고 해도 진짜 잘들어가더라구요.

단백질 정제용이니 이콜라이도 건강한 친구를 해야 단백질도 많이 만들어질테니...컴셀을 구매하시던가 아니면 잘되는걸 다른 방에서 받아오셔서 불려서 사용해보시는걸 추천합니다.

컴셀이 다들 문제라고 하시는군요...ㅜ

컴셀은 이번 2월달에 구매해서, 디퓨리저에 보관해놓고 실험 할 때 필요한 만큼 컴셀 tube를 꺼내서 얼음위에서 녹였습니다 ㅜ

구매한지 오래된것도 아니고, 녹였다가 다시 얼린 것도 아닌데 문제가 될 수 있는 가능성이 높은가요..?

혹시 도움이 될지 모르겠네요.
만일 CP cell 문제가 아니라면, Kana 항생제를 얼마나 사용하시는지 모르지만 절반정도로 줄여보세요.
Kana의 경우, 일반적으로 사용되는 농도에서 가끔 TF가 안되는 경우가 있습니다. 항생제 작용 기작때문인데.
여튼 CP cell 문제가 아니라면 한번 고려해보세요.
문제가 잘 해결되시길 바랍니다.

1. competent cell 을 바꿔본다

2. EtOH 정제 후 ddw로 dilution하고 ligation 시 vaccum 을 하거나 자연건조하여 농축한다

3. 항생제를 바꾸어본다.

4. DNA가 적정농도인 것이 중요합니다. 많다고 잘되는 건 아닙니다.

 

제 개인적으로는 11kb까지 벡터에 실어보기 위해서 colony 1만개 이상 해봤던 기억이 있네요.