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pcr와우
(비회원)
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22.05.18 15:40
먼저 여쭙고자 하는건..
1.pcr mixture은 D.W 36.5ml, dNTP 5ml, 10X buffer 5ml, forward primer 1ml, reverse primer 1ml, Taq polymerase 0.5ml, DNA 1ml 하여 총 50volume.
total 반응 reaction이 50ml이란 말인가요?... 좀 많은거 같은데요... ul단위겠지요?... 그리고 reaction vol이 좀 높은 편에 속한거 같은데 protocol은 lab에서 잡은 condition으로 한것인지요?
2. template DNA 는 무엇으로 확인 하였나요? 전기영동? nanodrop? DNA가 몇 ng이 들어갔는지 확인이 가능한가요?
PCR 후 전기 영동 에서 아무 bend도 보이지 않나요?
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레벨1
체리망규
(대학생)
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22.05.18 15:55
1.pcr mixture은 D.W 36.5ml, dNTP 5ml, 10X buffer 5ml, forward primer 1ml, reverse primer 1ml, Taq polymerase 0.5ml, DNA 1ml 하여 총 50volume. total 반응 reaction이 50ml이란 말인가요?... 좀 많은거 같은데요... ul단위겠지요?... 그리고 reaction vol이 좀 높은 편에 속한거 같은데 protocol은 lab에서 잡은 condition으로 한것인지요?
ul 단위입니다! protocol 은 랩에서 원래 짜여 있던거 그대로 써보고있어요,,!!
2. template DNA 는 무엇으로 확인 하였나요? 전기영동? nanodrop? DNA가 몇 ng이 들어갔는지 확인이 가능한가요? PCR 후 전기 영동 에서 아무 bend도 보이지 않나요?
젤 전기영동을 사용하고 있는데 처음에는 D.W 5, DNA2, 로딩다이1로 쓰다가 지금은 DNA5,로딩다이1로 하고 있어요.. 하지만 전기영동 후 아무 밴드도 보이지 않아요ㅜㅜㅜ
실험에는 문제가 없어보입니다.
template 문제이거나 primer 문제, 혹은 reagent 문제입니다.
template를 plasmid 형태로 보유중이라면 agarose gel 전기영동하여 밴드 확인이 되는지부터 확인하시고
sequencing 등의 방법을 통해 template 서열이 본인이 알고 있는 것과 같은지 확인할 필요가 있습니다.
cDNA library거나 cell lysate 등을 template로 사용하는거라면 target gene이 확실히 있는지 다시 한 번 확인해보세요
그 다음은 primer design이 제대로 되었는지 확인해야 합니다.
특히 학부생이나 갓 실험 시작한 대학원생들이 primer design 시 reverse complement 를 고려하지 않는 경우를 종종 경험했습니다.
이 마저도 확실하다면 reagent 문제를 의심해볼 수 있겠습니다.
요새 기본 구성이 모두 포함되어 있는 국산 PCR premix나 mastermix 가격이 그리 높지 않으니 해당 제품 사용을 추천드립니다.
추가로 cloning 목적이라면 Taq 보다는 Pfu 계열을 사용하세요.