흠,
저희 실험실에서는

트립신 처리후에 원심분리를 한다음 배지를 첨가하는데요_
이때 배지는 10%의 FBS와 1%의 PS를 첨가하여 줍니다_

그러면 남아있는 트립신은 많이 없을뿐더러, 있다 하더라고 FBS가 트립신의 영향을
억제해주는 역할을 해주어서, cell의 접착과 성장이 가능하다고 알고 있습니다.

이상 허접한 답변이였습니다..ㅎㅎ

7.5%가 되어도 cell이 자라는데에는 큰 영향을 주지 않습니다.
5%만 되어도 잘 자라니까요. ^_^

두분 답변 감사합니다.
그럼, final 5 % of FBS 를 1x Trypsin 을 inactivation 하는 minimum % 로 생각하고, trypsinization 후에 volume 을 계산해서 medium 을 가하면 되는지요? 그리고 가한 후에 centrifuge 를 하지않고 그냥 subculture 를 해도 괜찮다는 말씀이신지요?...

대부분 10%쓰는걸로 알고있습니다.

저 같은 경우에는 transformation 할때 5%쓰고 나중에 media change할때 10% 조건을 바꿔주거든요

아... 저는 cell 을 잘 자라게 하기 위해 일반적인 culture medium 내의 FBS % 가 궁금한 게 아니라, 1x Trypsin inactivation 하기 위해 최종 몇 % FBS 를 가해야 하는지가 궁금한 건데요...

아마도 보통 Cell타입마다 다를꺼란 생각이 듭니다.

만약 대략적인 양을 측정해보고 싶으시다면, 남는 Cell로 실험을 해보심이 어떨까요?

예를들어 Dish에 10% Serum Media가 1ml들어있다면 각 Dish별로

100, 200, 300, 400ul씩 Trypsin을 처리해보고 시간이 흐른 후

Cell이 얼마나 떴는지 관찰하는겁니다. 그럼 대략적인 비율을 계산할수 있지

않을까 하는 생각이 듭니다. 사실 이런 예기거리는 대부분의 분들께서

그냥그냥 그렇게 라고 생각할수도 있으니 말이죠 ^^;;

답변을 기다리시기보다 한번 직접해보시는것도 좋을것 같습니다.

저도 궁금하네요 ^^

윗 분들이 잘 대답해 주신것 같은데 헷갈리셨나보네요^^. 저도 trypsin inactivation에 쓰이는 정확한 FBS 농도는 모릅니다. 다만 모두일지는 모르겠지만 대부분의 랩의 경우 원심분리 후 culture 배지에 suspension시켜서 세포를 다시 adhesion시키는 방법을 쓰시는 것으로 알고 있습니다.

또 님께서 궁금해 하시는 사항에 대한 답변이 될지는 모르겠지만 위 질문사항은 저도 정확한 실험 근거를 알지는 못 합니다. 하지만 일반적으로 입에서 입으로 전해지는 노하우 같은 것으로, 처리된 trypsin양에 세배에 해당하는 배지(10% FBS 배지의 기준)를 가하면 trypsin이 inactivation 되는 것으로 저도 배웠습니다. 즉 trypsion의 세포탈착 활성을 없애는데 필요한 대략적인 최소 희석배수로 알고 있습니다. 정확한 양을 가해야하는 것은 아니니 trypsin 활성억제가 목적이라면 대략적으로 그 이상만 넣으시면 됩니다. 다만 세포 adhesion period와 그 이후 실험 및 배양에 있어서 안정적인 배양 조건을 조성해주고 특히 세포주가 아닌 체세포 등의 실험 중에 변수를 최소화 하기 위해서는 centrifugation을 하여서 trypsin이 포함된 PBS 또는 배지를 최대한 제거해주시고 보통 사용하시던 배지에 resuspension 후 배양을 계속 하시면 될 것입니다.

정리하자면, 세배 희석법은 trypsin inactivation을 위한 최소 배지첨가량이라고 생각하시면 될 듯 하며, 정확한 실험과 세포 자극 최소화를 위해선 centrifugation으로 trypsin을 제거한 후에 새로운 배지에 세포를 풀어 배양하시는게 옳다고 생각됩니다.

그렇군요... 실험 초보자로서는, 대부분의 랩에서 정확하게 농도를 정해두지 않고 그냥 구전되어 오는대로 따라 하신다는 좀 의아하기도 하고, 제가 중요하지도 않은 것에 너무 예민한가 생각되기도 하네요. 아무튼 답변 감사합니다. 그리고 제가 알기로는 centrifuge 또한 셀에 상당한 stress 를 주기 때문에 이틀에 한번씩 하는 subculture 할 때에는 안하는게 좋다고도 하던데요...

저도 이 곳에 계신 많은 실험도사 분들에 비한다면 부족하기 그지 없는 사람이지만...몇 가지 조언을 드려볼까 합니다^^

1) 트립신과 FBS
트립신은 아시는 바와 같이 세포 배양 중에는 부착세포를 탈착하기 위한 목적으로 쓰이는 효소입니다. 하지만 조금 더 넓은 목적에서 보면 트립신은 단백질 분해 효소이지요. 우리 체내에서는 대표적으로 소화기관에서 분비되어 음식물을 소화 시키는데 이용이 되지요. 트립신을 inactivation 시키는 방법은 여느 효소와 같이 온도, pH 등 단백질의 active site를 denature 시키는 법이나 또는 enzyme inhibitor를 이용하는 법이 있습니다. Trypsin의 inhibitor로는 대두 억제재(soybean inhibitor)가 있고, 또 동물의 혈청(serum)내에도 trypsin의 활성을 저해하는 inhibitor가 있다고 알려져 있습니다. 이런 점을 이용해서 cell subculture 중 trypsin으로 detachment 시킨 후, FBS가 포함된 배지(물론 trypsin inhibitor가 포함되어 있구요)로 trypsin activity를 억제하도록 하는것 입니다. 다만 그 정확한 농도를 알고 싶으시다면 trypsin의 효소활성 억제 정도를 FBS를 serial dilution한 샘플로 처리해본다면 추적이 가능할 것 입니다. 하지만 이런 실험을 하지 않는 이유를 아래에 설명 드리겠습니다.

2) 경험 VS 정확한 수치에 기준된 실험
정확한 수치가 아닌 경험을 토대로 입으로 입으로 전해오는 실험법에 불신이 가실수도 있다고 생각합니다. 세포를 다루어 보신지가 얼마되지 않았다면 더욱 더 그렇네요^^ 님께서 질문하신 사항은 초보자 입장에서는 매우 중요하다고 생각됩니다. 소위 과학자라고 하는 사람이 그런 의문 없이 그냥 전해지는데로만 따라해선 발전이 없겠지요^^ 대학원 생활을 금방 시작하신 것인지 아니면 세포를 처음 다루시는 분이신지는 잘 모르겠습니다. 전자라는 가정하에 설명을 드리겠습니다. 학부에서 배우는 대부분의 실험은 수학적, 물리적, 화학적으로 정확히 규명이 된 사항 들을 토대로 디자인된 것 들입니다. 그리고 대부분의 경우 정확한 농도로 농축, 희석이 가능한 고순도로 정제된 화학 시약을 사용하는 경우가 대부분 입니다. 하지만 이런 정확한 수치에 의존하여 디자인 된 실험을 세포실험에 적용시키기 힘든 부분을 설명 드리겠습니다.

정확한 FBS 첨가 농도 확립은 "완벽한" 실험을 위해서는 필요하다고 저도 생각됩니다. 하지만 이건 쉽게 말하면 "형평성"의 문제에 부딪치게 됩니다.
첫째로, 세포배양에 사용되는 생물학적 시약(배지, FBS, 효소 등등)은 생산 배치(LOT Number)에 따라 spec이 일정할 수가 없습니다 - 배치 별로 100% 동일한 생산조건을 조성해 줄 수 없으며, 100% 동일한 원재료로 쓰일 수가 없기 때문이죠. 생산조건은 생산중 특히 일정 온도 유지는 절대 불가능 한 것입니다. 상온 이상의 조건에서는 온도가 떨어지면 heating을 해주는 mechanism이고, 상온 이하의 조건에서는 온도가 올라가면 cooling 해주는 식이니깐요. 또한 특히 원재료를 생각해보시면 더욱 문제는 두드러집니다. 예를 들어 FBS의 경우 혈청을 뽑는 소 개체마다 혈청내에 포함된 인자들은 처낯만별로 변할 것입니다. trypsin의 경우도 높은 순도로 정제되긴 하지만 이동, 보관 과정에서 activity의 변화 등은 아무도 예측할 수 없죠. 하지만 시약 품질이 완벽히 일정하지 못 한 것은 세포를 고려할때 별로 큰 문제가 아닙니다. 우리가 세포 내에서 일어나는 일들 중 과연 몇 퍼센트나 알고 있을까요? 세포 또한 세포가 어떤 사람 또는 어떤 동물(나이, 성별, 영양상태, 성장 환경 등등등 무한한 변수를 가진 개체)에게서 isolation된 것인지, 또 각 변수에 ...

악! 많이 썼는데 많이 짤렸네요 ㅡ.ㅜ

간단히 정리하면 또 각 변수가 세포 그 자체의 특성에 미치는 영향 역시 무궁무진하지요. 즉 trypsin inactivation에 필요한 FBS 농도를 정확하게 계산하기란 쉽지 않은 일이고 또한 한다고 해도 매번 다른 LOT No의 시약을 사용할 때마다 다시 측정을 해봐야겠지요. 물론 어느정도 실험 후 통계분석을 통해 그러한 기준 수치를 구할 수는 있습니다. 이래서 생명관련 연구에는 통계분석이 굉장히 중요한것 같습니다. 물론 생명관련 연구외에 기초과학도 마찬가지지만요.

아...정말 많은 이야기를 적었는데 ㅎ 허무하게 날라가 버려서 급 요약을 해버렸네요.

어쨋든 지금 세포실험에 사용되는 소위 입에서 입으로 전해지는 실험 법들은 아마 수천만명의 과학자들이 수십년 동안의 실험과 경험을 통해 만들어진 정말 신뢰성 높은 데이터라고 생각됩니다. 다만 항상 개선의 여지는 둬야 과학자로서의 바른 태도 아닐까 생각됩니다. 저도 연구를 업으로 삼고 늘 배우는 입장에 있어서 가장 근본적인 부분을 다시 생각해보는 계기가 되었네요^^

아 centrifugation도 세포에 충분히 damage를 줄 수 있습니다. 물론 이것도 centrifugation에 의한 충격이냐 아니면 세포배지조성 변화와 잔존하는 trypsin의 활성이 어느정도 까지 억제되었냐 하는 부분을 잘 고려해야하는데요... trypsin은 세포시간이 길어지면 cell membrane도 파괴시킵니다 - 단백질이니깐요. 저 같은 경우엔 trypsin의 잔종량을 최소화 하는 것을 선택했습니다. inactivation과 inhibition의 차이가 크니깐요. inhibition은 어떤 조건이 주어진다면 언제든지 다시 활성을 띄게 되기 때문이지요... 하지만 둘다 문제점이 있습니다. 어느 것도 완벽한 조건을 조성해 줄 순 없다고 보여지구요^^ 연구자 본인의 선택에 따른 문제라고 생각됩니다^^

그럼 허접하고 길고 재미는 하나도 없으며...엉터리 일지도 모르는 제 답변 읽어 주셔서 감사합니다^^ 꾸벅

그렇군요... 재미있는 답변 감사합니다. 어디서 줏어듣기로는 FBS 농도가 cell differentiation 에 영향을 준다고 들어서요. 그래도 제 실험의 protocol 을 동일하게 한다면 (10% FBS 가 들어있는 medium 을 3배 넣어서 1X trypsin 을 inactivation 한다) 실험 결과에 영향을 미치거나 하진 않겠죠...

ㅎㅎㅎ 저도 줄기세포 만지던 사람이라서 그 수많은 변수들에 대한 고충을 잘 이해합니다^^ 세포분화에 영향을 미칠 수 있는 변수의 범위란...끝도 없지요^^ FBS는 수많은 인자들 중 하나이구요...^^ 본인이 생각하기에 변수가 될 수 있는 부분은 모두 constant하게 세팅 하는것이 좋겠지요...^^
말씀드렸지만은 FBS 안에는 무궁무진한 성장인자, 신호전달 펩티드, 영양성분 등등등.....이 포함되어 있고 그 중엔 당연히 분화에도 영향을 미치는 인자들이 있지요^^
FBS가 없는 serum free환경에서도 증식억제에 따른 분화가 당연 일어나게 되구요. 재미있게 연구하셔서 훌륭한 연구결과 내주시길 빌께요^^ 건승하세요^^