- colony PCR 보다 plasmid prep. 해서 band가 안나오면 cloning이 안된것으로
봐야 합니다.
- colony가 10개 정도 나온다면 ligation에 문제가 있는 것으로 보입니다.
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레벨1
djm0000
(대학원생)
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22.05.26 10:30
Speed님, 감사합니다.
colony를 따서 액체 배지에 키우면 정말 잘 자라있는데, 막상 DNA를 뽑았을 때, DNA가 없으면 이상한게 자란걸까요??
- 항생제를 정확히 넣었는데도 plasmid가 안나오면 plasmid가 없는 겁니다.
- 이런 문제는 앞뒤가 안맞는 느낌이 들지만 이유를 찾는 것 보다 실험을
정확히 다시하는 것이 좋을 듯 합니다.
- 전혀 다른 plasmid가 나오는 경우도 있는데 이런 경우도 이유를 찾기
힘듭니다.
- 어떤 host를 사용하나요?
- 2 cut cloning의 경우 colony가 잘 안나오면 insert의 문제가 큰 경우
입니다.
- ligation test를 해 보고 TF 하는 것이 필요합니다.
- cloning의 경우 vector와 insert를 잘 준비하면 95% 이상 한번에
성공합니다.
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레벨1
djm0000
(대학원생)
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22.05.26 10:52
Speed님, 답변해주셔서 감사합니다.
저희 실험실에서 쓰는 host는 DH5a입니다.
혹시 insert가 문제인지는 어떻게 확인할 수 있나요?
또 ligation test를 해 보았는데 mock 만큼은 아니지만 colony가 잘 생겼었습니다.
이런 상황이면 insert가 문제인 걸까요?
- 또 ligation test를 해 보았는데 mock 만큼은 아니지만 colony가 잘
생겼었습니다.
: 어떤 방법으로 test를 했나요?
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djm0000@naver.com
(비회원)
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22.05.26 11:08
Speed님,
mock vector을 먼저 restriction enzyme으로 자른 후 다시 ligation을 하여 transformation 시켜 배양 해 보았습니다. cutting에 문제가 있는 것인지도 확인하기 위해 cutting만 하고 배양하여 colony가 생성되는지도 확인하였는데 다시 ligation 시킨 vector는 colony가 뜨고 cutting만 한 vector는 colony가 뜨지 않았습니다. 그래서 ligation 문제는 아니라고 생각했는데 이런 방법으로 단정 짓기엔 섣부른가요...?
- Insert 가 혹시 조금이라도 발현이 되거나 하면 대장균 성장을 저해할 수 있는 종류인가요?
- Selection marker (항생제?) 가 잘 작동을 안 해서 대장균은 자라는데 플라스마드는 잃어버릴 가능성?
- 혹시 37도가 아니라 28도 정도에서 천천히 키워서 미니프랩 해보셨나요?
- vector 를 아무 처리 안 하고 transformation 하면 보통 콜로니가 아니라 잔디 (lawn) 가 깔리는 느낌으로 아주 많이 자라지 않을까요? Transformation 효율이 좀 낮은 게 아닐까요?
- ligation test는 ligase를 확인하는 test가 아닙니다.
- 실험에 사용하는 재료의 상태를 확인하는 것이 목적이기 때문에 현재
진행한 test는 실험에 사용하는 재료가 아니기 때문에 의미가 없습니다.
- 또한 아무 vector나 1 cut해서 붙인 후 TF 하면 colony가 잘 나옵니다.
- 이 실험으로 현재 2cut 실험의 문제를 확인하는 것은 아무런 관계가
없습니다.