> 3'에는 끝쪽에 18bp 정도 A로만 이루어진 구간이 있는데

혹시 이미 Poly A tail 까지 이미 다 잡아내신 게 아닐까요?  Poly A tail 은 유전체에서 전사되는 게 아니라, transcript 가 mRNA 가 만들어지는 과정에서 붙는 것이어서 이 부분까지 정확하게 cloning 할 필요는 없습니다.  아마 mRNA 분자들마다 polyA 갯수도 다 다를 테여서, 3' RACE 에서 잡힌 A 의 갯수는 중요하지 않습니다. 

보통 3' UTR 을 지나 Poly A signal sequence 랑 tail 까지 3' RACE 에서 잡혔으면 full-length 클로닝이 된 것으로 봐야 한다고 생각합니다. 

polyA 뒤에 sequence가 꽤 길게 있는데도 full length라고 볼수있을까요?? sequencing 보냈을때 이 부분이 안 읽히는게 뭔가 잘 안 되고 있나 싶습니다..

> polyA 뒤에 sequence가 꽤 길게 있는데도 full length라고 볼수있을까요?? sequencing 보냈을때 이 부분이 안 읽히는게 뭔가 잘 안 되고 있나 싶습니다..

(1) polyA 뒤쪽에 염기서열이 더 있다고 하셨는데, 3' RACE 결과물을 vector 에 클로닝해보셨는지요?  클로닝하셔서 vector 에 있는 primer 로 시퀀싱을 해보시면, 아마도 poly A 부근까지 반대쪽으로부터 읽어볼 수 있으리라 생각합니다. 시퀀싱이 잘 안 되는 것은 뭔가 강한 secondary structure 같은 게 생겨서 방해를 하고 있는 것인지도 모르겠네요.  PolyA 뒤쪽에 있는 염기서열이 짧다면 그냥 3' RACE 를 위해 쓰였던 primer 의 머리 부분일 수도 있지 않을까요?  (NCBI BLAST 등을 통해 확인을...) 

 

(2) 혹시 ORF 는 끝까지 다 잡혔나요?  

3' RACE 는 한쪽은 known primer, 다른 쪽은 cDNA 에 poly A tail 이 있다고 가정하고 여기에 상보적인 primer 를 써서 증폭을 했던 것으로 기억합니다. 

만약 ORF 내부나 3' UTR 내부에 정말로 AAAA ... 가 18개씩 이어지는 부분이 유전체 서열에도 존재하고, 이 AAAA... 너머로도 많은 염기서열이 더 있으리라 생각하신다면, 3' RACE 에서 known primer 쪽을 가능한 한 이 AAAA ... 서열에 바짝 붙여서 다시 한번 해보시면 어떨까 싶네요.

 

(3) RACE 를 수행하시는 샘플의 유전체 서열은 알려져 있는지요?  가장 중요한 것은 유전체에도 정말 3' 부근에 AAAA ... 서열이 있는지, 아니면 지금 보고 있는 것이 poly A tail 인지 (그렇다면 그 너머에 있는 서열은 무엇인지) 가 되겠습니다.  

유전체가 알려져 있지 않다면 genomic DNA 를 template 로 해서 이번 3' RACE 를 통해  TAIL PCR 같은 것을 해보아서 정말 유전체에도 AAAA ... 서열이 있는지 확인하는 방법도 있겠네요.  번거롭겠습니다만 ...