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질문 RACE 도와주세요 ㅜㅜ
알하핫호홋(대학생)  | 2022.06.18 10:21

dsRNA를 denaturation 시키고 Roche kit로 5', 3' RACE를 진행하고 있습니다.

5'쪽은 여러번 sequencing 보내서 컨펌한 상황이고

3'에는 끝쪽에 18bp 정도 A로만 이루어진 구간이 있는데

그래서 그런지 sequencing을 보내면 몇개가 없거나 몇개가 많거나

아니면 저 부분에 프라이머가 달라붙어서 끝까지 증폭이 안 되고 있습니다.

이런 경우 어떻게 하면 성공시킬 수 있을까요,,,

거의 반년도 넘게 끙끙거리고 있네요ㅜㅜ 도와주세요 ㅜㅜ  

#RACE
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리크옷  |  2022.06.18   

> 3'에는 끝쪽에 18bp 정도 A로만 이루어진 구간이 있는데

혹시 이미 Poly A tail 까지 이미 다 잡아내신 게 아닐까요?  Poly A tail 은 유전체에서 전사되는 게 아니라, transcript 가 mRNA 가 만들어지는 과정에서 붙는 것이어서 이 부분까지 정확하게 cloning 할 필요는 없습니다.  아마 mRNA 분자들마다 polyA 갯수도 다 다를 테여서, 3' RACE 에서 잡힌 A 의 갯수는 중요하지 않습니다. 

보통 3' UTR 을 지나 Poly A signal sequence 랑 tail 까지 3' RACE 에서 잡혔으면 full-length 클로닝이 된 것으로 봐야 한다고 생각합니다. 

알하핫호홋  |  2022.06.18   
polyA 뒤에 sequence가 꽤 길게 있는데도 full length라고 볼수있을까요?? sequencing 보냈을때 이 부분이 안 읽히는게 뭔가 잘 안 되고 있나 싶습니다..
개구리크옷  |  2022.06.19   

> polyA 뒤에 sequence가 꽤 길게 있는데도 full length라고 볼수있을까요?? sequencing 보냈을때 이 부분이 안 읽히는게 뭔가 잘 안 되고 있나 싶습니다..

(1) polyA 뒤쪽에 염기서열이 더 있다고 하셨는데, 3' RACE 결과물을 vector 에 클로닝해보셨는지요?  클로닝하셔서 vector 에 있는 primer 로 시퀀싱을 해보시면, 아마도 poly A 부근까지 반대쪽으로부터 읽어볼 수 있으리라 생각합니다. 시퀀싱이 잘 안 되는 것은 뭔가 강한 secondary structure 같은 게 생겨서 방해를 하고 있는 것인지도 모르겠네요.  PolyA 뒤쪽에 있는 염기서열이 짧다면 그냥 3' RACE 를 위해 쓰였던 primer 의 머리 부분일 수도 있지 않을까요?  (NCBI BLAST 등을 통해 확인을...) 

 

(2) 혹시 ORF 는 끝까지 다 잡혔나요?  

3' RACE 는 한쪽은 known primer, 다른 쪽은 cDNA 에 poly A tail 이 있다고 가정하고 여기에 상보적인 primer 를 써서 증폭을 했던 것으로 기억합니다. 

만약 ORF 내부나 3' UTR 내부에 정말로 AAAA ... 가 18개씩 이어지는 부분이 유전체 서열에도 존재하고, 이 AAAA... 너머로도 많은 염기서열이 더 있으리라 생각하신다면, 3' RACE 에서 known primer 쪽을 가능한 한 이 AAAA ... 서열에 바짝 붙여서 다시 한번 해보시면 어떨까 싶네요.

 

(3) RACE 를 수행하시는 샘플의 유전체 서열은 알려져 있는지요?  가장 중요한 것은 유전체에도 정말 3' 부근에 AAAA ... 서열이 있는지, 아니면 지금 보고 있는 것이 poly A tail 인지 (그렇다면 그 너머에 있는 서열은 무엇인지) 가 되겠습니다.  

유전체가 알려져 있지 않다면 genomic DNA 를 template 로 해서 이번 3' RACE 를 통해  TAIL PCR 같은 것을 해보아서 정말 유전체에도 AAAA ... 서열이 있는지 확인하는 방법도 있겠네요.  번거롭겠습니다만 ...  

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