실험 Q&A Cell Biology > Cell Cycle
Cell cycle analysis 질문드립니다... 살려주세요 ㅠㅠㅠ
레벨1 쥬쓰 (대학원생)
안녕하세요 현재 ROS activity, Apoptosis rate에서 Apoptotic cell 증가 확인 후 Cell cycle analysis 진행중인 대학원생입니다...
논문에서 나온 프로토콜로 진행중인데 도저히 G0/G1 phase, S phase, G2/M phase 층 생기는게 관찰되지 않습니다.
이렇게 찍혀버리는데 왜 층이 안생기는지 모르겠어요...
프로토콜은 다음과 같습니다.
1. 6well plate에 well당 10만 seeding
2. chemical 처리 후 24hr treatment.
3. Media, DPBS washing buffer, Trypsin-EDTA 후 Media 추가한 용액까지 전부 모음.
4. 상층액 제거 후 DPBS resuspension, 300g로 5분 centrifugation 후 상층액 suction.
5. 상층액 suction 후 각 PBS 500ul로 resuspension
6. chilled 70% ethanol in DW로 4.5ml 약하게 vortexing 하면서 첨가
7. 4도 냉장고에 30분 이상 incubation (or more)
8. incubation 후 300g로 5분 centrifugation.
9. 상층액 suction 후 PBS 5ml로 resuspension
10. 300g로 5분 centrifugation.
11. 상층액 제거 후 PI staining solution (0.1% Triton X-100, 100ug/ml RNaseA, 15ug/ml PI in PBS) 각 Sample당 1ml로 resuspension후 37도에서 10분 암조건으로 incubation
12. FACS 측정.
여기서 혹시 제가 어떤 문제가 있을까요...? 프로토콜 논문을 2개를 찾아보면서 이것저것 1달을 해봤는데 도저히 층이 생기지 않아서 여쭤봅니다..... 살려주세요.... cell cycle했던 사람들이 다 졸업하거나 사라져서 물어볼 사람이 없어요,,,
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