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질문 Triple KO (TKO) 제작 시 selection
알JMadison(과기인)  | 07.07 18:17

안녕하세요,

TKO 만들다가 너무 애먹고 있어서 도움을 요청하려고 합니다.

첫번째 KO을 stable하게 만들때 blasticidin selection을 이용하였고, 두번째에 CRISPR gRNA-Cas9-Puro 발현을 이용하여 퓨로마이신 selection 이용하여 selection 하고 세번째로 gRNA-GFP 발현을 이용하여 sorting 하려고 했는데 GFP sorting 에 어려움을 겪고 있습니다.

 

혹시 클로닝을 이용할수 있거나 완제품으로 판매중인 plasmid중 blasticidin 과 Puro 와 겹치지 않는 selection 방법이 있을지요..

 

항생제 selection이 아무래도 가장 빠를것 같아서 겹치지 않는 항생제를 찾고 싶은데 일반적으로 TKO를 어떤 방법으로 만드는지 궁금하여 여쭤봅니다.

 

부디 도움 주시면 감사하겠습니다!

#antibiotics
 
#항생제
 
#TKO
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리bio  |  07.08 05:46  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

sorting의 문제가 GFP 발현이 되지 않는 것인가요?

CRISPR gRNA-Cas9-Puro 벡터에 gRNA가 있는데요 

여기에 있는 gRNA와 다른 시퀀스 인가요?

G418 있기는 하지만 GFP 발현이 보이지 않는다면 큰 차이 없을거 같습니다.

알JMadison  |  07.08 11:09  

bio 님, 감사합니다.

제가 TKO라는 내용만 적고 자세한 내용을 적질 않아서 죄송합니다.

두번째 gRNA와 세번째 gRNA는 서로 다른 유전자의 시퀀스를 타겟팅하는 서로 다른 gRNA 입니다.

그래서 세번째 gRNA-GFP를 transduction시킨 후 GFP 솔팅을 통해 세번째 gRNA의 발현 여부를 확인하려던건데 GFP 솔팅 후에도 세번째 유전자의 KO이 관찰되지 않아서요..

말씀해주신대로 G418 포함하는 plasmid를 찾아보거나 정 안되면 클로닝 하여 사용해야 할까보네요..

TKO는 만들어본적이 없어서 보통 세가지 유전자를 KO 시킬때 어떻게 사용하는지 어렵네요..

도와주셔서 감사합니다.

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