안녕하세요, 현재 HEK 293에 C-term his tagtransmembrane protein을 transfection 시킨 후 단백질 정제를 시도하는 중에 막혀 질문 남깁니다.
문제는 비드에 타겟단백질보다 다른 non-specific 단백질이 더 강하게 바인딩한다는 것입니다. (cell lysate에서는 발현 확인)
먼저 protocol에 대해 간략하게 설명드리자면
buffer
- 50 mM sodium phosphate buffer (pH8.0)
- 150 mM NaCl
- 0.005% Tween 20
- 1 mM TCEP
- 20 mM Imidazole (binding/washing)
- 50~200 mM Imidazole (elution)
- protease inhibitor
* Tween 20은 0.05, 0.1%까지 사용해보았으며 tris buffer pH7, pH8 모두 사용해보았고, NaCl도 300 mm 까지 사용해보았으며 200 mM 이후 bead에서도 non-specific band만 있고 target은 없는 것을 확인하였습니다.
1. Cell을 scraper로 뗀 후 centrifuge (4000~10000g 3 min)
2. Binding buffer로 pellet을 풀어준 후 sonication 1분 진행 (1sec on/ 1sec off)
3. 평형시켜놓은 Ni-NTA bead 와 1시간 binding (4도)
4. washing 및 elution
이것저것 조사중에 membrane protein extraction 과정이 있던데, 대부분 bacteria에서 진행하거나 이를 통해 WB를 확인하는 용도더라구요. 대부분 centri를 통해 membrane fraction pellet을 얻던데, extraction 후 똑같이 풀어주어서 his tag purification 을 진행해도 되나요? 아니면 다른 방법이 있을까요..? mammalian cell 에 대해서는 잘 안나와있어서 혹시 참고할 만한 문헌을 알려주시면 감사하겠습니다ㅠ ㅠ
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