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웹진 Vol.24, No.8 (2022년 8월) 발간
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 [westernblot] Cleaved caspase-3 안티바디 디텍션 안되는 이유
앞다리experiment(대학원생)  | 08.03 16:44

안녕하세요.

Western blot 실험에서 apoptosis 억제 관련 인자인 caspase를 확인하려고 하는데 35kDa에서 full length caspase-3는 잘 확인이 되는데 17kDa에서 cleaved caspase-3가 안뜹니다.

upload_image

혹 이유를 아시는 분들 계실까요? 해당 antibody로 실험을 해보셨거나 하고 계신 분들 있으시면 조언 부탁드립니다.

일단 저는 cell signalling(#9662) 이 제품을 사용하고 있고, western 실험 조건은 10% gel에서 일반적인 로딩, wet 트렌스퍼 조건 따르고 있습니다.  

+) 덧붙여, 혹 cleaved 형태는 발현되지 않고 caspase-3만 발현되면 apotosis를 억제한다고 보기는 힘든거겠죠? cleaved된 형태 없이 caspase-3 단독으로만 결과를 제시한 논문은 못본듯하여 질문드립니다. 

#westernblot
 
#웨스턴블랏
 
#caspase
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-_-  |  08.03 16:48   

약을 치거나 해서 아포토시스 유도는 하셨죠? 관련 내용이 글에 없어서 물어봅니다.

대왕개구리SPEED  |  08.03 16:51  
apop. 조건에서 억제 시켰나요?
앞다리experiment  |  08.03 16:52  

넵, 당연히 유도하였습니다. H2O2로 산화스트레스 처리하였고 위 band에서 두번째가 stress처리군입니다. (*첫번째 band:control)

저는 17kDa에서 아예 아무런 band가 확인되지 않는게 가장 큰 고민입니다. 그 이유 역시 잘 모르겠구요,,

대왕개구리SPEED  |  08.03 17:04  
처리시간, 농도는 어떻게 되나요?

당연히 고민을 해결하려면 가능성을 좁혀들어가야 합니다.

앞다리experiment  |  08.03 17:12  

200uM, 1h 처리하였습니다.

앞다리experiment  |  08.03 17:16  

사실 이 샘플이 어느정도 apotosis 억제능이 있다고 판단한게 caspase-3뿐만 아니라 BAX antibody도 같이 확인했는데 여기서는 경향성이 나왔거든요,,

upload_image   upload_image

위 결과는 b-actin대비 BAX 발현양 입니다. 

대왕개구리SPEED  |  08.03 17:17  

- 24hr, 0, 200, 400, 600 처리해 보세요.

알텔루르  |  08.03 17:50  

H2O2 상태는 괜찮았나요?

저도 학위할 때 oxidative stress 가해야 하는 일이 종종 있었는데 apoptosis이 잘 안일어난 일이 있어서 확인해보니 H2O2가 문제였더군요

생각보다 열이나 빛에 민감해서 사용하기 전에 fresh한 상태인지 확인해보는것이 좋습니다.

 

https://www.researchgate.net/publication/234110563_Factors_Affecting_Decomposition_of_Hydrogen_Peroxide

456  |  08.03 18:02   

apoptosis 유도한 세포 사진을 보여주셔야 할 것 같은데요.

apoptosis 유도가 안된 세포상태인데 약물 그냥 처리하고 apoptosis유도되었다고 착각하는 경우가 있더라고요.

라프  |  08.07 16:08   

윗분들 말씀처럼 apoptosis 유도과정이 제대로 이루어졌는지

억제약물을 제외한 H2O2로만 유도시킨 샘플에 대해 15, 17kDa에서 밴드가 뜨는지 검증을 먼저하셔야 할 것 같습니다.

혹시 유도과정이 제대로 되었다는 확신이 있으시면 쓰고 있는 caspase-3 외에 같은 excutioner caspase 역할을 하는 caspase-7의 cleaved form을 확인해보세요.

저도 caspase-3의 cleaved form을 같은 제품으로 본적이 있는데 다른 항체들에 비해 cleaved form이라 그런지 노출시간을 늘려도 잘 안뜨는 경우가 많았습니다.

그에 비해 cleaved caspase-7은 상대적으로 밴드가 잘떴었는데, 보통은 apoptosis발생시 caspase-3/-7이 모두 activation되므로 이를 확인해보는것도 좋을 것 같습니다. 

덧붙여서 20kDa 이하 단백질이라 10% gel은 다소 %가 낮은게 아닌가 합니다. 저같은 경우는 14% gel을 사용했었는데 이부분은 랩마다 다를수 있어서 문제없으면 그대로 하셔도 될 것 같아요.

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