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BioLab 이은열 교수
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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 lentiV2클로닝중인데 transformation이 안됩니다ㅠ
알hihalo(대학생)  | 08.09 15:54

 comp cell은 DH5a를 사용중이고,  vector는 lentiV2를 이용중입니다

제가  primer 20bp크기를 insert하려는데 콜로니가 안떠서 고수님들께 자문구합니다.

 

DH5a는 RBC에서 구매해서 사용중이라 문제는 없는것같습니다.

BsmB1으로 자르고 gel extraction 후 밴드 잘린거 확인했습니다.

 

comp cell 20ul에 plasmid 1.7ul넣고

transformation은

ice 20 min

42도에서 heat 45 sec

ice 20 min

뒤에, S.O.C 50ul 넣고 37도  shake incubator에 1시간 배양 후 

lb+amp plate에 모두 spread합니다

 

콜로니가 아예뜨지 않는데 어떤 단계를 확인하거나 바꿔야 할까요

vector도 바꿔보고 glass beads로  non-heat 으로도 해보고, ligation 단계에서 ATP도 넣어봤는데 콜로니가 안뜨네요ㅠㅠ 

도움 부탁드립니다.ㅠ

 

#transformation
 
#DH5a
 
#cloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-_-  |  08.09 17:08   

대충 검색해서 보니 DH5Alpha는 렌티바이러스용 벡터 클로닝에 안 쓴답니다.

Comp.Cell을 Stbl3 같은 렌티바이러스용 이콜라이로 바꾸세요.

https://www.researchgate.net/post/Could_we_use_the_DH5alpha_instead_of_Stbl3_for_lentiviral_plasmid_transformation_and_cloning

https://blog.addgene.org/plasmids-101-common-lab-e-coli-strains

---이하 수정 내용---

https://media.addgene.org/data/plasmids/52/52961/52961-attachment_B3xTwla0bkYD.pdf

대왕개구리SPEED  |  08.09 17:19  

- 해당 vector는 RecA- 균주를 사용하기 때문에 DH5a도 사용가능합니다.

알hihalo  |  08.10 10:32  

protocol 에 stbl3쓰라는 것은 알지만 지금 갖고있는게 없어서 Dh5a를 이용중입니다 이 실험에서 DH5a은 mutation 가능성이 있지만 comp cell로 충분한 역할을 한다고 알고있씁니다.

-_-  |  08.10 11:47   

negative control은 잘 뜨나요?

comp.cell 20ul에 ligation product를 1.7ul 넣는 이유가 있습니까?

https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=640861

여기 답글에 나온 대로 컨트롤들을 다 만들어서 스텝마다 체크하신 적이 있습니까?

대왕개구리SPEED  |  08.10 12:11  

- 안자른 plasmid를 동일한 양으로 TF하면 어떻게 나오나요?

알hihalo  |  08.12 11:23  

speed , -_- / 오...negative ctrl은 안자른 벡터로 트포하면 되는걸까요? 와..

-_-  |  08.12 15:54   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

위 링크에 걸린 답글처럼 정말 내가 어느 단계에서 문제가 생겼는지 알고 싶다 하면

컨트롤을 여러 개 세분해서 스텝마다 알아보는 거는 거죠.

일단 지금 안 잘린 lentiV2 플라스미드를 TF 시도해서

현재 Comp.Cell인 DH5alpha에 TF되는지 안되는지부터 알아보고,

프로토콜에 나온 대로 인서트 없이 그냥 잘랐다 붙인 것도 TF되나 안되나 보세요.

전자가 안 되면 Comp.Cell을 바꿔보던가 stbl3을 구해보시고,

후자가 안 되면 라이게이션 스텝의 문제고... 

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