실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
Gelatin zymography 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ band가 아에 없어요,,,
레벨2 sjsj3636 (대학원생)
안녕하세요 zymography를 처음 해보는 석사생입니다ㅠㅠ 도움 받을 분이 없어서 혼자 진행해봤는데요,, Gelatin zymography를 통해서 MMP-9의 활성을 보려고 했는데 밴드가 아에 뜨지를 안습니다,, Sample을 prep은 먼저 6웰 플레이트에 A549 cell을 깔고 부착후 starvation하였고 후에 cell을 자극하고 시료를 처리하여 conditioned media를 모았습니다(starvation부터 모든 media는 SF media를 사용했구요) 이 샘플로 MCP-1 등의 ELISA 측정을 하였고 최종적으로 zymography를 수행했습니다,,!ㅠㅠ Zymography의 모든 젤과 시약은 invitrogen novex제품을 사용했는데요, Conditioned media를 LDS sample buffer(4x)로 4배 희석시켜준 후에 로딩하여 90V로 3-40분 정도 전기영동하였고 후에 renaturing buffer(1x)에 30분, developing buffer(1x)에 30분 상온에 둔 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37도에서 overnight 했습니다. 후에 wash 3회 진행하였고 simplyblue safestain으로 1시간 gel 염색 후 d.w로 1시간 탈색하였습니다. 근데 아에 밴드가 뜨질 않아요,, 염색 후에도 밴드가 안보였으나 그대로 진행해봤는데,, 왜 안뜨는걸까요?,,, 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
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