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BioLab 이은열 교수
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 528  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western blot 밴드가 점묘화처럼 찍혀나오는 문제
알헤우니(대학원생)  | 08.17 16:06

upload_image

위에 더블밴드 뜨는건 맞는데 밴드 모양이 이상해요...

교수님께 여쭤 봤더니 젤을 좀더 신경써서 만드는게 좋겠다는 말만 들어서요....

젤은 13.5%sds page gel 만들어서 씁니다.

아래 밴드는 GAPDH구요. 

위 밴드는 14, 16kDa입니다.

당연히 같은 gel에 로딩한것입니다.

젤은 전날에 만들어둔거 썻습니다.

안티바디는 얼려놨던걸 재사용 했어요. 이부분도 문제가 생길까요..?

젤 말고 다른 원인은 없을까요?

#Western Blot
 
#protein
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.17 20:10  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- gel 문제로는 보이지 않습니다.

 

- GAPDH band를 보면 전기영동 속도가 빠릅니다.

 

- 항체는 O/N으로 붙였나요?

456  |  08.18 12:05   

셈플희석해서 5 ul 전후로 loading해보세요

알헤우니  |  08.22 14:38  
1차는 over night 했구요 2차는 1h했습니다 tbst washing은 10분씩 3회 했습니다
전기영동은 80v 2h했습니다...샘플 문제일까요
대왕개구리SPEED  |  08.22 14:55  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 80V, 2hr은 문제가 없어 보이며 sample 조성에 salt가 많이들어 있나요?

 

- blocking은 어떻게 했나요?

알헤우니  |  08.22 15:03  

sample 조성은 cell 깬 lysis buffer(포닥분이 만드셔서 조성을 몰라요.) d.w,

5x sample buffer (100ml기준)

0.25 Tris pH6.8 50ml / 10% sds 10ml/ 30% glycerol 30ml / DW up to 100ml

1ml씩 e tube에 나눠서 0.2M b-mecapto EtHO 35ul/1ml 넣고 -20 보관합니다.

사용시에는 녹인 후 사용하고 4도 보관합니다. 

 

blocking은 5% skim milk 에 1h 했습니다.

대왕개구리SPEED  |  08.22 15:53  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- blocking은 shaking을 하면 되고 sample은 heating 후 원심분리 후 sup.만

사용하면 좋습니다.

 

- 전체적으로 큰 문제가 안보이기 때문에 다시 해보면 정상적으로 나올것으로

보입니다.

 

- loading양은 너무 많이 하는 것이 좋지 않으며 현재양으로 충분할 것으로

보입니다.

알헤우니  |  08.22 15:59  

넵ㅠㅠㅠ감사합니다

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