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qRT-PCR standard curve 관련 문의
레벨1 lIlllIIlllIIIll (일반인)
안녕하세요. qRT-PCR을 이용하여 연구를 진행하고 있습니다.
여쭤보고 싶은 것은 DNA copy수를 이용한 standard curve 작성과정에서 R^2값은 0.99이상인데 PCR efficiency가 낮게 나오는 문제입니다.
ABI Quantstudio 6 Flex모델을 이용하며, Taqman mastermix사용하였고, 10^8 ~ 10^1 copy가 되도록 plasmid serial dilution 하여 Primer/Probe를 이용한 standard curve 작성을 위한 PCR 실시하였습니다.
Amplicon size는 150-300 bp 정도입니다.
PCR cycle은 95도 15초, 50도 30초, 72도 30초로 40 cycle 실시하였습니다.
Ct mean 값을 이용한 그래프 작성 후 기울기값을 이용하여 efficiency확인한 결과 50~60%정도로 확인이 됩니다.
샘플 한두개라면 primer 자체의 efficiency문제라고 판단하겠으나 10 여개 primer와 plasmid를 이용한 분석에서 공통적으로 50~60% efficiency가 나오고 있어 의문이 들어 질문을 드립니다.
Primer inhibitor가 될 만한 물질은 포함되지 않았고, primer 자체의 효율이 낮은 것이라면 Primer와 plasmid의 조합이 이렇게 많은데 다 낮은 efficiency를 가지는 primer를 짤 확률이 낮다고 생각합니다.
전문가분들이 보시기에는 어떻게 생각하시나요?
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