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- 전부 안떨어진것은 어떻게 계산했나요?
- 현재 IEX 조건이 어떻게 되나요?
- 1M에서 안떨어진 것으로 보이는 것은 실험 오류일 겁니다.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 17:43
원래 40개 바이알 안에 정제해야하는데 그 뒤로 적은 양으로 계속 나와요ㅠㅠ (피크가 너무 뒤쪽에 뜬다해야할까요..?)
조건은 SP FF (5ml)양이온 컬럼 썼고,
단백질 PI값 : 8.97
용출액 : 10% 50mM sodium acetate, 1M NaCl (pH4.5)
Conditioning buffer : 90% 50mM sodium acetate (pH4.5)
이거예요..!
- 1M로 조금 더 받으면 될 것 같습니다.
- 정제 조건이 조금 안좋습니다.
: pI 8.97이면 AEX는 사용할 수 없기 때문에 CEX를 사용하는 것은
맞습니다만 붙이는 조건이 pH가 너무 내려갔습니다.
- 이렇게 강하게 붙이면 높은 농도의 salt를 사용해야 하고 나중에 buffer
chang도 시간이 걸립니다.
- 적당한 조건은 7~7.5 정도면 0.2M안에 떨어질 겁니다.
- 그리고 IEX에 사용하는 buffer는 %로 표시하지 않고 M로 표시하는 것이
조건 확인하는데 편리합니다.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 18:36
논문 참고해서 실험 중인데 효소 단백질이 낮은 pH에서 안정적이여서 pH 4.5로 하는 것 같습니다..!
제가 아직 논문에서 설명된 조건대로 buffer를 만들었는지 아직 잘 모르겠는데 혹시 확인해주실 수 있나요ㅠ 옛날 논문이라 아마도 FPLC를 이용하지 않은 것 같아서요ㅠ
- 평형화
: 45mM sodium acetate, pH4.5 -> 5mM sodium acetate, pH4.5, 0.1N NaCl
- elution
: 50mM sodium acetate, pH4.5, 1N NaCl을 사용하여 0%->100% elution
- 논문 제목이 어떻게 되나요?
- IEX 설명이 조금 정확하지가 않습니다.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 18:50
'계내금 단백질 분해 효소의 정제와 특성' 입니다!
그쵸.. 설명이 부족해서 실험에 애먹고 있습니다ㅠㅠ
- 논문을 읽어 보니 pH영향은 크게 걱정하지 않아도 될것 같습니다.
- CEX resin을 사용하고 pH7 정도로 실험하면 될것 같습니다.
- 평형화는 20mM Na or K Pi buffer, elution은 0~1M NaCl로 linear gradient를
사용하면 될것 같습니다.
- 현재 loading sample은 어떻게 평형화하나요?
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 19:22
아하.. 감사합니다ㅠㅠㅠ 매번 배워갑니다ㅠ
20mM sodium acetate (pH4.5)에서 4시간에 한번씩 새 dialysis buffer를 갈아서 24시간 투석하여 얻은 단백질 샘플을 사용하고 있습니다!
- 논문에 20mM 이라고 나와있지 않은데 왜 20mM로 평형화했나요?
- IEX는 반드시 resin과 loading sample은 동일 조건으로 평형화해야 합니다.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 19:33
그렇군요.. 논문에서 ammonium sulfate 침전 후에 20mM sodium acetate(pH4.5) buffer로 투석한 것을 샘플 사용했더라구요..!
위 조건이 논문의 IEX 조건하고는 안맞습니다.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 19:43
음.. 그럼 다음부터는 투석을 20mM sodium acetate, 0.1 NaCl (pH7.0)로 하는게 좋겠죠?
- pH7.0은 phosphate buffer입니다.
- NaCl 0~1M gradient입니다.
- 위 답변에 설명을 해 놨는데 다시 한번 잘 보세요.
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레벨2
jyun1009
(대학생)
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22.08.31 20:05
넵! 감사합니다!