실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
low MW western 실험 도움 요청합니다.
레벨1 seraph924 (대학원생)
안녕하세요. 4kDa 단백질(amyloid beta 42) 잡기 위해 웨스턴 조건 잡고 있습니다.
맴브래인 단백질이 최대한 잘 붙게 하기 위해 아래와 같은 조건으로 진행을 했습니다.
그런데 사진처럼 5kDa 근처 맴브래인만 특이적으로 투명화 되는 현상이 반복적으로 일어나고 밴드가 잡히지 않습니다.
이런 현상이 일어나는 원인이 무엇인지 알고 계신 분 자문 부탁드립니다... 그리고 low MW 단백질 잡기위한 좋은 팁 알고 계시다면 첨언 부탁드립니다.
<웨스턴 조건>
1. Gel casting
- 4~20% gradient gel 사용
- Running at 100V for 50~60min
2. Transfer
- MeOH per ct. 40% (맴브래인 접착 높이기 위해 40%로 높임)
- Membrane pore size: 0.2um (PVDF)
- 70mA for 1hr
- After transfer, membrane boiling (T-TBS(0.05%) for 5min) and semi dry
3. Blocking
- 3% BSA in T-TBS for 1hr
4. Antibody
5. Wash
- 0.05% T-TBS( wash 하면서 단백질 lose 줄이기 위해 트윈 20 비율 줄임)
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