실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
단백질 정량(Bradford/BCA assay) 계산이 잘 이해되지 않습니다..
레벨1 notorious choi (과기인)
안녕하세요.
western blot을 진행하는데 두 분의 선임이 각각 실험하시는 과정을 보고 정리하여 혼자 실험을 하려고 하는데요,
그런데 두 분의 단백질 정량 계산법이 달라 무엇이 맞는지 정확히 알지 못하여 선생님들께 도움을 구하고자 합니다.
먼저 첫번째 선임의 방법입니다.
cell pellet lysis 후 Bradford 방법을 이용하여 standard 농도를 0, 1, 2, 4, 8로 지정 후 측정한 결과입니다.
단백질 100ug의 100ul 샘플용액을 제조하고자 할 때
sample number(Conc.) | 넣을 protein 양 | reducing buffer | sample buffer | lysis buffer |
WT(7.9ug/ul) | 100/7.9=12.7ul | 100/10=10ul | 100/4=25ul | 100-12.7-10-25=52.3 |
#11(6.1) | 100/6.1=16.4 | 100/10=10 | 100/4=25 | 48.6 |
실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : NP-40, reducing buffer : Bolt sample reducing agent(10x), sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다.
위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다.
그렇다면 제가 넣은 단백질 양은 30ug이 맞나요?
다음은 두번째 선임의 방법입니다.
제 담당 선임이셔서 계속 이 방법으로 실험을 진행해야 하는데 계산과정이 이해되지 않아서요..
cell pellet lysis 후 BCA assay kit를 이용하여 측정했습니다.
sample number | Conc.(ug/ml) | ratio to 최소양 샘플 | 4x buffer | 필요샘플양 | 1x buffer | 원하는 final wb 샘플 양 |
#1 | 1369.500 | 5.989 | 26.5ul | 13.27ul | 66.23ul | 106ul |
#5 | 228.667 | 1.000 | 26.5 | 79.50 | 0.00 | 106 |
실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : M-PER mammalian protein extraction reagent, sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다.
1x buffer는 4x buffer를 H2O에 희석하여 만들었습니다.
위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다.
위 표대로 만든 샘플은 106ul에 각각 228.667ug의 단백질을 가지고 있는 건가요?
30ul를 로딩했을 때 제가 넣은 단백질 양은 어떻게 되나요?
최저농도로 나온 샘플의 양이 얼마인지 피펫팅으로 대략 파악 후 엑셀에 대입하여 주신 자료입니다. 왜 이렇게 최저농도인 샘플의 양에 맞춰 나머지 샘플 모두 계산을 하는 것인가요? 첫번째 선임의 실험방법보다 이 실험법이 더 정확한건가요?
H2O 대신 1x buffer를 넣는 이유는 무엇인가요?
그리고 만들어진 gel을 사용하는데 well 안에 running buffer를 채운 후에 샘플 loading 해도 되나요?
빈 well은 소량의 ladder를 넣은 후 샘플과 동량 맞추기 위해 부족한 양만큼 1x sample buffer를 넣어주나요?
transfer 할 때 filter paper와 membrane이 함께 들어있는 novex filter paper sandwich 0.2um pore size를 이용하는데요, methanol에 담갔다가 transfer buffer에 적셔 이용하는 것은 filter paper인가요? membrane인가요?
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