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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 232  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 HisPur Ni-NTA Purification시 Protein aggregation
올챙이agaz(대학생)  | 09.20 11:14

안녕하세요, 저는 현재 A라는 eukaryotic protein을 E.coli에서 발현 중에 있습니다. A라는 protein을 insoluble하게 발현하여 activity가 있는 것을 확인했으며, A라는 Eukaryotic protein을 B라는 protein과 한 T7 promoter상에서 연결하여 발현 중에 있는데, 제가 원하는 site에서 보이지 않아 질문을 남겨봅니다.

Vector는 pET28a(+)를 사용하여 N,C-ter 양쪽 모두 His-tag이 붙어있습니다.

Induction condition은 16~37도 까지 Time 역시 바꿔가면서 Optimization을 모두 진행해보았는데 되질 않는 것 같습니다. 

제가 Target으로 하는 예상 kDa는 62kDa인데, Induction후에 whole protein, pellet에는 예상 kDa부근에서 보이는데 Elution시에는 보이지 않고 30kDa부근에서 보입니다. Elution은 imidazole 250mM~300mM로 진행하였습니다. 따라서 protein이 insoluble하거나 His-tag 정제 시 문제가 있는 것 같아 보이는데, 해결이 되질 않습니다. 제가 놓친 부분이 있을까요? 참고로 loading 시 boiling도 하였고, 중간에 종결코돈도 없습니다.

아래 사진 첨부드립니다. 감사합니다.

upload_image

#6xHis
 
#protein purification
 
#extract
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.20 12:01  

- induction +/ - 전기영동은 없나요?

올챙이agaz  |  09.20 12:07  

Induction +/-에서의 차이도 확인하였습니다.

대왕개구리SPEED  |  09.20 12:15  

- 자료가 제한적이어서 판단하기 힘듭니다만 indicution이 안된거 안닌가요?

 

- PPT를 어떤 처리 후 정제했나요?

 

- FT는 전기영동 결과가 없나요?

올챙이agaz  |  09.20 12:46  

1.Induction은 다른 Data와 비교한 결과 됐다고 생각합니다.! 그리고 만약 안됐다고 한다면 Transformation하지 않은 (-)con BL21(DE3)와 비교했을 때도 65kDa부근에서도 보였습니다. 

2,3 PPT와 FT가 무엇의 약자인지 찾질 못했습니다. protein purification과, Induction유무에 대한 질문이 맞을까요?

1234  |  09.20 13:02   

loading 시 2-ME 넣으셨나요 혹시? disulfide bond로 된 dimer 형태인가 싶어서요

대왕개구리SPEED  |  09.20 13:02  

- ppt = precipitation =  insoluble fraction.

 

- 발현 단백질이 물에 녹지 않을 텐데 어떤 방법을 진행한 후 정제를 했나요?

 

- FT = flow through

시료를 resin에 붙인 후 안붙은 fraction 자료가 전기영동에 없습니다.

올챙이agaz  |  09.20 13:31  

1234-

네 b-Mer가 포함된 protein staining Dye를 넣고 95도씨에서 10분 boiling 후 loading하였습니다. 또한 발현된 protein은 Cys기를 총 2개 가지고 있습니다. 

올챙이agaz  |  09.20 13:38  

speed-

1.lysis후 supernatant를 취하고 남은 pellet을 lysis buffer(PBS or other buffer)로 풀어준 후 다른 protein과 동일하게 boiling후 loading하였습니다.

2. Figure에 Binding buffer라고 적혀있는 부분이 binding되지 않은 fraction이며 Equilibration buffer로 내린 protein입니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.20 13:44  

- resin에 cell lysis 후 insoluble fraction을 boiling한 후 붙였다는 얘기 인가요?

 

- 변성한 후 붙이지 않았나요?

올챙이agaz  |  09.20 14:03  

His-tag purfication과 SDS-PAGE는 각각 다르게 진행하였으며, 
Insoluble fraction(pellet)은 His tag purification을 진행하지 않았고, supernatant만 purification을 진행하였습니다. 

또한, 제가 말씀드린 Boiling은 purification이 다 끝난 후 loading전에 Disulfide bond를 끊어주어 linear한 형태로 만들기 위해 한 것입니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.20 14:14  

- A는 insoluble하게 발현되었는데 A+B는 soluble하게 발현되었나요?

올챙이agaz  |  09.20 17:25  
본문에 내용을 잘못 적었네요, 죄송합니다.A라는 eukaryotic protein 을 soluble하게 발현하였으며, B와 ligation하여 발현 시 insoluble해진 것 같다는 예상입니다! 정제 후 Bradford 진행 시 125ug/mL정도의 농도가 나옵니다.
대왕개구리SPEED  |  09.20 17:53  

- 내용이 바뀌는 것 같은데 A = soluble, A+B = insoluble이라면 "Insoluble

fraction(pellet)은 His tag purification을 진행하지 않았고, supernatant만

purification을 진행하였습니다. " 라고 했는데 A+B를 sup으로 정제하면

안되는거 아닌가요?

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