NaOAC, EtOH는 얼마나 사용했나요?
배양액은 1tube에 몇ml 사용했나요?
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사람살려
(대학원생)
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22.09.22 11:23
안녕하세요.
NaOAc는 최종 농도가 0.5M이 되도록 사용했고, EtOH는 NaOAc와 상층액을 합친 것 만큼보다 10배가 되는 부피를 넣어주었습니다. (1mL가 나와 EtOH를 10 mL 넣어주었습니다.)
또한 cell은 OD를 맞추어 1mL씩 사용했습니다.
- 배양액 기준 몇 ml를 사용했나요?
- 최종 사용한 원심관과 원심분리 조건은 어떻게 되나요?
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사람살려
(대학원생)
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22.09.22 12:48
박테리아마다 3 mL씩 배양하였고 OD를 맞추기위해 계산하여 0.7~0.8 mL정도 되는 배양액을 LB로 희석시켜 총 1 mL를 만들어주었습니다.
15 mL와 50 mL conical tube를 모두 사용해보았고 최종 원심분리 조건은 16000g 10분이었으나 pellet이 하나도 보이지 않았습니다..
- 양이 적어서 그렇습니다.
- G(-)균을 사용했나요?
- 아래 방법으로 해 보세요.
1. 균 배양
2. 배양액 1ml 원심분리, 2회 멸균수 washing
3. DW 500ul -> 100oC, 15min
4. 중성 phenol 500ul vortex -> 65oC, 15분 -> vortex 10sec x 3times
5. 13krpm, 15min, 4oC
6. [200ul sup + 100% EtOH 1.2ml] x 2ea
7. -20oC 2hr
8. 13krpm, 15min, 4oC
9. dry
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사람살려
(대학원생)
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22.09.22 13:20
답변해주셔서 정말 감사합니다. 질문 드리고 싶은 것이 조금 더 있는데 답변 한번만 더 주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ
1. 논문에 적혀있는 것과 cell 수를 맞추기 위해 희석을 시킨건데ㅠㅠ혹시 그럼 speed님께서는 cell OD가 어느정도일 때 LPS 추출을 진행하실까요?
2. 또한 cell 수가 적어도 적은 양이라도 LPS가 추출이 되어야 맞을 것 같은데 하나도 되지 않아서 의아했습니다..cell이 많이 부족한 것일까요?
3. 답변자님께서는 따로 NaOAc를 넣지는 않으실까요?
4. 마지막으로 LPS를 추출하여 보관할 때 7번 스탭에서 보관하시는 편이신가요 아님 최종 추출 후 보관하시는 편이실까요?
1. 논문에 적혀있는 것과 cell 수를 맞추기 위해 희석을 시킨건데ㅠㅠ혹시 그럼 speed님께서는 cell OD가 어느정도일 때 LPS 추출을 진행하실까요?
: O/N culture 기준으로 시험하는데 3~5OD 사이 정도일겁니다.
2. 또한 cell 수가 적어도 적은 양이라도 LPS가 추출이 되어야 맞을 것 같은데 하나도 되지 않아서 의아했습니다..cell이 많이 부족한 것일까요?
: 추출이 되어도 cell이 적으면 안보입니다.
3. 답변자님께서는 따로 NaOAc를 넣지는 않으실까요?
: 1가 양이온을 넣어도 되지만 EtOH 80%이상이면 크게 차이가 없습니다.
4. 마지막으로 LPS를 추출하여 보관할 때 7번 스탭에서 보관하시는 편이신가요 아님 최종 추출 후 보관하시는 편이실까요?
: 질문에 추출 후 보관할 때라는 전제가 있기 때문에 추출 후 전기영동에서 확인되면 액상으로 소분한 후 냉동보관하면 됩니다.
추출 중간에는 보관하는 것은 좋지않습니다.
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사람살려
(대학원생)
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22.09.22 20:16
친절한 답변에 다시 한 번 감사드립니다!
알려주신 방법으로 다시 시도해보겠습니다!!!!
좋은 밤 되세요!