실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Extraction/Isolation
protein extraction 후 protein 농도에 관한 고민이 있습니다.
레벨1 맞는길을고르지 (대학생)
안녕하세요, 매번 검색만 하다가 처음 질문 남겨봅니다.
protein extraction을 하고 정량을 했는데 protein 농도가 터무니없이 적게, 거의 안 넣었다고 봐도 될 정도로 나왔습니다. 샘플마다 값도 너무 튀고요.. 동일한 조건으로 이전에 실험했을 땐 이정도로 적게 나오진 않았어서 매우 당황스럽습니다.. 제가 복기 해봤을 때 기존과 크게 다른 점이 없어서 너무 답답합니다. 앞으로 이 분야를 더 배우고 싶은데, 단백질 추출도 못하면 무슨 실험을 진행할 수 있겠나 싶어서 막막합니다.
제가 아직 학부생이라 부족한 점이 많습니다... 제가 한 실험 과정과 정량 후 결과값은 아래에 첨부해두었습니다. 잘 부탁드립니다.
lung cancer cell 4*10^5으로 6well에 seeding >> 18h 후 80%정도 찬 것을 확인 후, 시료처리 >> 24h 후 protein extraction
<extraction>
1. media suction 후 well당 cold DPBS 1mL로 washing >> suction후 cold DPBS를 well당 1mL씩 넣고 스크래퍼로 긁어준 뒤 따서 e-tube로. 3000rpm, 5min, 4℃ centrifuge
; 여기까지 진행했을 때 처리한 시료 농도가 높았던 샘플 하나(B3라고 하겠습니다)가 pellet이 안 보였습니다.
2. 상층액 suction 후 RIPA solution 넣고 강하게 피펫팅 >> 강하게 볼텍싱 >> ice에 꽂아놓고 20min incubating(5min 간격으로 강하게 볼텍싱 해줬습니다.)
; RIPA+P.I.+PMSF를 1:0.01:0.001로 섞어서 RIPA solution을 만들었고, 위에서 언급한 B3는 20uL로, B3를 제외한 나머지 샘플들은 80uL로 pellet을 풀어줬습니다.
피펫팅은 100uL짜리 피펫으로 거품이 날 정도로 세게 여러번(제 체감상으로는 한 40번정도 피펫팅한 것 같아요)했습니다.
3. 15000rpm, 20min, 4℃ centrifuge >> 상층액만 따서 새 e-tube에 넣기
; centri 끝나고 나니까 첫 centrifuge 사용때보다는 줄었지만 pellet이 보였고, B3에서도 아주 조그만 pellet이 보였습니다.
상층액은 80uL로 푼 샘플들은 75uL, 20uL로 푼 샘플은 15uL정도 딸 수 있었습니다.
4. 정량
1, 2, 3, 4, 5는 standard A1~3, B1~3은 sample입니다.(A1, B1은 CTR)
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | A1 | A2 | A3 | B1 | B2 | B3 | |
DDW | 18 | 14 | 10 | 6 | 2 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 |
RIPA | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
sample | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
BSA | 0 | 4 | 8 | 12 | 16 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
DC A | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
DC B | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 |
단위 : uL
표와 같이 조합 후 볼텍싱해주고 상온에서 15min incubating >> 96well에 well당 200uL씩 넣고 750nm 흡광도 촬영
5. 계산
표 윗줄은 최근 실험 결과, 표 아랫줄은 이전 실험 결과입니다.
R^2 | A1(CTR) | A2 | A3 | B1(CTR) | B2 | B3 | |
0.9906 | 1uL당 농도 | 0.579531 | 0.265105 | 0.295931 | 1.424168 | 1.07275 | 0.172626 |
0.9902 | 1uL당 농도 | 1.005952 | 0.809524 | 0.815476 | 2.029762 | 1.863095 | 1.369048 |
현재 이런 상황입니다. 저희 랩실 사람들이 80uL로 풀었을 땐 대부분 람다당 농도가 1은 넘습니다.
저의 고민은
1. 왜 람다당 농도가 거의 0에 수렴하는가?
2. 왜 람다당 농도가 샘플마다 이렇게까지 차이가 나는가?(추출 전 육안으로 cell상태 확인했을 때 confluency랑 비례하지도 않음..)
이렇게 두 가지 입니다. 제발 문제점을 파악해서 잘 해결될 수 있으면 좋겠습니다..
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