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BioLab 장재봉 교수
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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 Qiagen Rneasy mini kit로 RNA 추출
알석나(대학원생)  | 2022.09.25 19:45

안녕하세요 실험에 대해서는 아예 모르는 초짜 대학원생입니다ㅠㅠ

졸업 논문을 위해 실험을 하게 됐는데, Cell에서 RNA를 추출해서 qRT-PCR을 돌려야 합니다.

현재 Qiagen RNeasy mini kit로 cell에서 rna 추출을 하고 있는데, 최소 6번은 했는데도 spectrophotometer로 흡광도 측정해봐도 아무것도 안 나와서 멘붕입니다.. 혹시 제가 하고 있는 과정 중 잘못됐거나 추가해야 될 점이 있으면 조언해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ

 

*추출 전에 Buffer RLT 1 ml 당 B-ME 10 ul 첨가하고, Buffer RPE에 96-100% 에탄올 44ml 첨가했습니다*

 

*RNA 추출*

1. 6-well plate에 키우고 있어서 6 well plate 안 상층액 버리고, PBS로 wash했습니다.

2. RLT 350 ul 넣고 기울인채로 피펫 끝으로 긁어서 모이게 한 다음 튜브에 옮겨서 1분동안 vortexing했습니다. 후에 70% 에탄올 350 ul 넣고 피펫팅 10회 해서 섞었습니다.

3. 혼합한 700 ul를 spin column에 옮겨서 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. (그런데 이렇게 했을 때 막 위쪽에 하얗게 될 때도 있고 액체가 다 밑으로 안 내려올 때도 있습니다. Cell 양이 너무 많아서일까요ㅠ)

4. RW1 700 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다.

5. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다.

6. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 2분 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다.

7. Spin column을 새로운 2 ml collection tube에 넣고 뚜껑닫고 10000g에서 1분 원심돌렸습니다.

8. Spin column을 새 1.5 ml 튜브에 옮기고 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣었습니다. 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다.

9. 8번에서 한 그대로 같은 튜브에 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다.

10. Spin column 제거하고 뚜껑 닫고 18 ul씩 4개로 나눠서 -80도씨에 보관합니다.

 

보관하기 전에 spectrophotometer로 아무리 재봐도 값이 안 나옵니다ㅠㅠ 너무 답답합니다..

짚이는 것은 cell 양이 너무 많은지, 피펫팁으로 긁어오는게 너무 부족한지, vortexing을 너무 높은 속도에서 하는지, 알코올 넣고 피펫팅을 너무 조금 하는지 세게 하는지.. 이런 것들이 원인일까 싶기는 합니다ㅠ

추출은 실험대에서 하고 있고, 추출하기 전에 알콜로 소독하고, 피펫도 Rnazap? Rnase 제거하는 용액 뿌려서 닦고 피펫팁은 autoclave 돌린 것 사용하고 있습니다. 가운 입고 마스크 쓰고 말은 안하고 라텍스 장갑 끼고 rnazap 뿌려서 비빈 다음 진행하고 있습니다.
 

고칠 점 있으면 부디 알려주시기 바랍니다ㅠㅠㅠㅠ 감사합니다.

#RNA extraction
 
#Rneasy mini kit
 
#RNA 추출
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-_-  |  2022.09.26    

매뉴얼을 읽어봤는데 homogenizing step을 안 하셨네요.

샘플이 안 갈렸으니 추출이 안 되는 거 아닐까요?

3. Homogenize the lysate according to step 3a, 3b, or 3c. See “Disrupting and homogenizing starting material”, pages 18–21, for more details on homogenization. If processing ≤1 x 105 cells, homogenize by vortexing for 1 min. After homogenization, proceed to step 4. Note: Incomplete homogenization leads to significantly reduced RNA yields and can cause clogging of the RNeasy spin column. Homogenization with a rotor– stator or QIAshredder homogenizer generally results in higher RNA yields than with a syringe and needle.

3a. Pipet the lysate directly into a QIAshredder spin column placed in a 2 ml collection tube, and centrifuge for 2 min at full speed. Proceed to step 4.

3b. Homogenize the lysate for 30 s using a rotor–stator homogenizer. Proceed to step 4.

3c. Pass the lysate at least 5 times through a blunt 20-gauge needle (0.9 mm diameter) fitted to an RNase-free syringe. Proceed to step 4.

 

456  |  2022.09.26    

spectrophotometer로 측정하셨다고 하는데 양이 얼마나 나왔나요?

RNA양이 10 ng/ul 미만으로 나와도, RNA 10 ng정도만 cDNA합성하고 qPCR해도 결과는 잘나옵니다.

음..  |  2022.09.26    

제 개인적인 생각으로는 cell양이 적은거 같습니다.

100파이정도에서 키우셔서 1:2로 나누어 뽑아보세요. 

개인적으로 RNA키트는 RNAse 보호에는 너무 좋은데

yelide가 좋지 않더라고요.. 

Trizol Methods방법도 추천합니다. 

 

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