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질문 실험데이터 이해가 안됩니다 제발 도와주세요...!
알살려주세요(대학원생)  | 09.26 17:08

안녕하세요.

제목 그대로 실험 데이터가 이해가 안됩니다ㅠㅠㅠㅠ

지금 target siRNA로 cell에 KD을 시켜서 Real Time PCR결과를

보면 mRNA expression이 증가하는 반면 같은 cell을 KD시켜서   western blot

을 하면 protein level이 감소한걸 확인 할수 있습니다. 혹시 왜 이렇게 되는지

아시는 분 있으면 제발 도와주세요ㅜㅜㅜ 

#siRNA
 
#mRNA
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리현직백수  |  09.26 18:55  

안녕하세요. 

siRNA transfection후 프랩 시점이 어떻게 되는지요? 

mRNA와 protein은 시간차가 있습니다. 

바로 감소하고 감소하지는 않더라구요. 

그리고 oligo형태로 transfection하면 특정시간 후 리커버리 됩니다.

농도를 먼저 잡고, 타임 디펜던트로 해보셔야 할것같습니다. 

..  |  09.26 23:17   

qPCR과 WB은 실험 목적이 다릅니다.

단백질 발현을 관찰하는 것이 목적이라면 qPCR은 필요 없는 실험입니다.

 

알살려주세요  |  09.27 17:53  

안녕하세요. 

보통은 transfection 후 48시간 뒤에 harvest를 하고있었습니다! 

그런데 결과가 이상하게 나와 농도별로도 해보고 시간대 별로 (24H, 36H, 48H)

프랩을 해도 똑같은 결과가 나옵니다ㅠㅠㅠ 이미 프라이머랑 시약은 너무 많이

바꿔본 상태입니다! 혹시 이유를 아시면 도와주세요ㅜㅜㅜ

알인천실험자  |  09.28 09:45  

기본적인 이야기지만, qPCR을 위해 isolation 했던 RNA에 genomic DNA contamination이 없었는지 따로 확인하셨을까요? gDNA가 섞여있으면 qPCR 결과가 뒤죽박죽으로 나오더라구요^^;; 

학생  |  09.28 13:30   

작성하신 글과 댓글을 봐서는 반복 실험에서 단백질이 감소된 것을 확인 하셨으면 siRNA를 통한 표적 단백질 감소는 잘 이뤄졌으나 RT-PCR 과정에서 문제가 있다고 보는게 좋을 것 같습니다. primer를 mRNA만 특정할 수 있도록 다시 제작하셔서 진행해보시는 것은 어떨까요? 

 

예를들어 primer 한 쪽을 exon 사이 구간으로 제작하면 sample에 소량 genomic DNA가 있더라도 mRNA에만 민감하게 RT-PCR 진행하실 수 있을 것으로 생각됩니다. ( F 또는 R중 하나의 primer를 exon (n)과 exon(n+1 or n-1)의 말단과 말단 부분 모두를 포함하는 mRNA에만 존재하도록 설계해보세요.)

알크르릉  |  09.28 14:23  

Real Time-PCR은 어떤 방식으로 진행하나요?

윗 분 말처럼 PCR에서 문제가 있다고 봅니다.

SYBR로 이용하면 비 특이적으로 반응한 primer를 통해서도 false-positive가 나올 수 있기 때문에 primer확인 잘 하셔야 할 것 같습니다.

알킴소장  |  09.28 14:52  

같은 사례는 아니겠으나 일전에 elect shock 으로 같은 경험 있었는데 lipofection 으로 해결해본적은 있습니다.

개구리안녕난세포야  |  09.30 08:54  

읽는 시퀀스랑 siRNA 시쿼스랑 다른부위라서 그럴수도 있지 않나요?

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