안녕하세요.

RNA 추출 정제 퀄리티 분석에 질문이 있어 브릭 선배님들께 질문드립니다. 

저는 미세조류를 연구중인 박사과정생입니다. 

RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 주로 해오다, RNA-seq 분석을 위해 준비중입니다. 

세포를 대량 배양한 뒤 stress를 제공하고 전체 전사체 변화를 관찰하는 것을 목적으로 하고 있습니다. 

문제는 새로운 균주를 분리하였는데, 그 균주의 mRNA purity에 문제가 있는 것으로 보입니다. 

먼저 고농도의 mRNA을 얻고자 Trizol method를 이용하여 추출 후 전기영동하여 확인했습니다 (TBE, 100mV, 15min, 1% gel).

1번 2번 3번 모두 서로 다른 균주입니다.

근데, 2번 샘플만 smear가 형성되며 밴드가 잘 확인되지 않습니다. 

260/230 결과도 좋지 않게 확인됩니다. 농도는 좋은데, 농도가 왜 높게 나왔는지 원인 파악이 어렵습니다. 

trizol reagent 존재 하에 cool-homogenization 이후, chloroform을 처리하였고, 12000g 에서 15분 원심분리하였습니다. 1,3번 샘플들과 달리 2번에서만 보이는 특징은... 유일하게 노란색 상층액이 형성되었습니다. 이를 isopropanol 처리 후 pallet을 형성하였을때 불투명한 베이지색 pallet이 형성되었습니다. 

다행이 DW에는 잘 녹았지만, quality를 믿기 어려운 결과가 나와 재실험을 들어갔습니다. 

농도를 포기하고 purity를 높이기 위해 membrane column형식의 gene all kit (RiboEX )를 이용하여 RNA를 추출하였습니다. 

이때 탄수화물/당류의 오염을 고려하여 cell이 담긴 RiboEX 용액에 chloroform을 처리하는 것이 아니라, homogenization 이후 cell debris와 RiboEX 용액을 분리한 뒤 chloroform을 처리하였습니다. 이후 12000g에서 30분간 원심분리하여 최대한 깨끗한 상층을 얻고자 하였습니다. (원심분리 이후 상층액의 노란 정도는 줄었지만, 여전히 깨끗하진 않습니다)

시료를 세 가지 다른 방식으로 추출하였습니다(필터 제거, debris 제거, 필터 및 debris 제거 등).  그 결과 3번 샘플이 260/280; 260/230 모두 괜찮게 나와 기대를 갖고 전기영동을 내려보았습니다. (TBE, 100mV, 12min, 1% gel)

 야속하게 18S, 28S 밴드가 보이지 않습니다.

또 특징 중에 하나가, 이 샘플의 경우 trizol 및 RiboEX method 모두 가장 높은 peak가 260nm가 아닌 270nm에 가깝게 나타났습니다. 이러한 경우 오염에 의해 RNA-seq 분석이 어려운 상태인지 선배님들의 견해가 궁금합니다. 

또, RNA 전기영동시 rRNA 밴드가 형태가 끈적한 물질에 의해 smear처럼 형성하는 것인지, 혹은 실제로 RNA가 다 분해된 것인지 의견을 여쭈어 보고 싶습니다. 

브릭에서 올라온 해결 방안들을 보면서 여러가지 method를 실험해보았지만, 명확한 해결 방안을 찾지 못했습니다. 경험 많으신 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다. 

감사합니다.