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레벨5
실험은안될때가더많아
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22.10.17 11:52
제가 이해한 것이 맞은지 모르겠습니다
클로닝하고자하는부분이 cagaattcc로 시작하는데 primer 프로그램에서는 agaattcc로 추천해주었다면 앞에 한자리 빠진 c를 primer에 포함시키지않는다면 c deletion된 product가 되겠네요.
Anneal될 부분은 cagaattcc가 다 포함되어야할 것 같습니다.
EcoRI recognition site GAATTC 앞에 랜덤 6자리를 넣어주셔야(ex. cgctct) enzyme이 해당부분을 읽고 자릅니다.
추가적으로 mammalian 용이면 ATG앞에 kozak sequence인 gccacc를 추가해주시면 도움되구요.
- EcoR1 GAATTC+ start codon ATG + ag aat tcc
: EcoRI이 ATG 양쪽에 들어가는 건가요?
- 양쪽에 들어가면 사용하지 못합니다.
- 바깥쪽 효소자리가 있으면 반드시 여분의 염기를 붙이지 않으면 안잘립니다.
- 정확히 만들고 싶은 primer 서열이 어떻게 되나요?
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레벨1
꼭
(일반인)
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22.10.17 13:21
실험은 안될때가 더 많아님 답변 감사합니다^^
SPEED님 답변 감사합니다.
제가 primer를 제작하기 위해 본문에 쓴 sequence는 예시로 EcoR1의 sequence가 양쪽에 들어가는 건 아닙니다.^^
제가 primer를 제작하려고 하는 염기서열의 일부입니다.
aga cgt cag cct atc ccc aag gca cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc~~~gaa gac ggc gtg aac tat gca aca ggg aac ctt cct ggt tgc
파란색으로 표시한 부분이 primer를 제작하려고 하는 부위이구요.
3개씩 나눈 건 translation이 되는 걸 확인하기 위해 나눈거였습니다.frame 확인 겸, 그런데 primer 제작하려는 부위를 보면 5'-3'부분이 aga 부분 중 ga만 되어 있어 a를 포함하여 해야할지 질문드린거였습니다.
reverse primer는 gca가 거꾸로 들어가는거니 tgc로 될 거고, 거긴 3개의 sequence가 다 들어가니 추가로 sequence를 넣어주지 않아도 되는 게 맞는거지요? gaa부분 중 aa만 들어가니 추가로 넣어줘야 하는걸까요?
제가 primer를 제작하려는 sequence는
5'-3' : GAATTC ATG (A)GACGTCCTATCCCCAAG
3'-5-' : AAGCTT TAG TGCATAGTTCACGCCGTCTT
이렇게 제작 하려고 한건데 맞는걸까요?
- 5'-3' : GAATTC ATG (A)GACGTCCTATCCCCAAG
: ATG 뒤의 frame이 GAC로 시작되면 A가 필요없고 AGA로 시작되면 A가
필요합니다.
- F의 경우 ATG 뒤의 염기가 어떻게되나요?
- 증폭되는 전체 서열을 ATG 뒤로 3 frame으로 종결 codon까지 문제가
없는지 확인해 보세요
- R의 경우 종결 codon이 잘못되었습니다.
- 위의 답변에서도 적었지만 F, R 모두 여분의 염기가 없으면 안 잘립니다.
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레벨1
꼭
(일반인)
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22.10.17 13:59
- F의 경우 ATG 뒤의 염기가 어떻게되나요?
: ATG 뒤의 염기가 AGA~~입니다.
본문 질문에 작성되었듯이 CDS 부분이 아니여서 제한효소 뒷부분에 start codon을 넣어준 것입니다.
- R의 경우 종결 codon이 잘못되었습니다.
: 종결 codon이 잘못되었다는 게 어떤 의미일까요? TAG가 stop codon이니
primer 제작시에는 GTA로 들어가야 맞는것일까요?
- 위의 답변에서도 적었지만 F, R 모두 여분의 염기가 없으면 안 잘립니다.
: 여분의 염기라고 하심은 NEB에 나온 것처럼 CCG(GAATTC)CGG 이렇게
넣으면 되는것일까요?
- CDS든 아니든 ATG가 개시코돈으로 작용하면 이후는 3개 base씩 번역이
됩니다.
- F, R 사이의 전체 서열을 기준으로 base를 확인해 보세요.
- TAG라면 R은 CTA입니다.
- 3개 정도 염기를 넣으면 됩니다.
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레벨1
꼭
(일반인)
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22.10.17 14:22
SPEED님 답변 감사합니다.
정말 너무 많은 도움이 되엇습니다^^