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질문 Gel extraction 수율 문제
올챙이수박고구마(대학원생)  | 2022.10.18 15:27

안녕하세요

 

cloning을 진행중인 학생입니다.

 

제한효소 처리를 통해서 자르면 아래 처럼 선명하게 잘리고 양도 굉장히 많은데, gel extraction만 하면 수율이 굉장히 낮아집니다.

upload_image

upload_image

제가 사용하는 gel extraction kit 방법은

GM buffer를 넣고 50도에서 10분간 녹여준 다음

column에 넣고 13000rpm 1분 centri

이후 wash buffer 넣고 13000rpm 1분 centri

후 빈 column 한 번 더 13000rpm 1분 centri 하여 완전히 말려주기

빈 column에 elution buffer를 넣고 조금 기다렸다가 13000rpm 1분 centri 하는 것 입니다.

 

프로토콜 상에는 문제가 없는 것 같은데 혹 짐작 가는 원인이 있으신지 여쭙고 싶습니다.
#gel extration
 
#plasmid
 
#cloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2022.10.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- column을 몇개로 실험하는지 모르겠지만 1개에 하지 말고 여러개로 하세요.
올챙이수박고구마  |  2022.10.18   

column은 3개를 사용하고 있습니다.. 더 늘려야할까요..?
대왕개구리SPEED  |  2022.10.18   

- 1band당 3개 인가요?

 

- 4024bp + 869bp 시료, 3777bp + 1120bp 시료는 각각 loading양이 얼마인가요?

 

- elution후 4024bp, 1120bp는 각각 elution 총양이 얼마인가요?

 

- 아래 전기영동 사진은 elution 후 loading양이 각각 얼마인가요?
올챙이수박고구마  |  2022.10.18   

- 1band당 3개 인가요?

네 맞습니다

- 4024bp + 869bp 시료, 3777bp + 1120bp 시료는 각각 loading양이 얼마인가요?

plasmid형태라서 ng/ul는 측정하지 않았습니다.

upload_image

- elution후 4024bp, 1120bp는 각각 elution 총양이 얼마인가요?

총량은 50ul으로 둘다 동일합니다

- 아래 전기영동 사진은 elution 후 loading양이 각각 얼마인가요?

2ul입니다
대왕개구리SPEED  |  2022.10.18   
ul를 비교하면 충분합니다.

자른것은 각 몆ul 전기영동인가요?

3개 tube에 50ul이면 한개에 몇ul elution인가요?

올챙이수박고구마  |  2022.10.18   

자른것은 각 몆ul 전기영동인가요?
-2ul 씩 내린 것입니다

 


3개 tube에 50ul이면 한개에 몇ul elution인가요?

-20ul로 elution 하고 모으면 로스 감안하고 50정도 됩니다
대왕개구리SPEED  |  2022.10.18   
1번 사진이 10ul 잘라서 2ul loading한 것인데 양이 상당히 많네요.

현재 kit로 예전에는 잘 되었나요?

방법에는 큰 문제가 안보이는데 washing buffer가 오래되지는 않았나요?

elution은 2번 나눠서하고 37도에서 5분있다가 원심분리 해 보세요.
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