실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Transformation
DNA ligation 및 transformation 과정 관련해서 궁금한 점이 있습니다.
레벨2 형준팍 (대학생)
안녕하세요 이제 막 실험수업 듣는 학부생입니다!
transformation 이후 Amp+plate에 배양하여 다음날 colony가 뜨는지 확인하러 갔는데 하나도 없었습니다.
물론 저는 transformation과정에서 생긴 문제라고 인지는 하고 있어요.
(ex. CaCl2를 pellet에 녹일 때 pipetting을 너무 쎄게 했다던가, 스프레딩을 쎄게 했던가 등등..)
그런데 transformation을 하기 전에 insertDNA와 plasmid DNA를 ligation을 했는데 혹시나 이 과정도 transformation을 하는데 영향을 줄 수 있는지 궁금해서 질문 드립니다.
1:1 | 1:3 | |
insert(약280bp) 약26ng/ul | ||
vector(약4200bp) 약30ng/ul | 2ul | 2ul |
SDW | ||
T4 DNA ligase | 1ul | 1ul |
10X ligation buffer | 2ul | 2ul |
Total | 20ul | 20ul |
실험할 당시 ligation 관련 protocol입니다. total volume과 10x ligation buffer, T4 DNA ligase의 volume은 고정해 두었고, vector는 농도 50ng/ul을 맞춰주기 위해 2ul로 진행하였습니다. (인서트와 벡터의 분자량과 농도는 대략적인 수치로만 나타냈습니다)
조교님은 인서트와 벡터의 ng의 비율만큼 넣는 방법을 알려주셨는데, 인서트와 벡터의 볼륨비로 해도 상관은 없기 때문에 볼륨비로 진행한다고 하셨고, 저희는 그대로 insertDNA를 각각 2ul, 6ul만큼 넣어주었습니다.
여기서 궁금한 점은.. 10X ligation buffer의 볼륨을 2ul로 고정하는 이유가 무엇인가요?
1) 벡터와 인서트의 ng비로 1:1을 맞추면 인서트는 0.15ul정도만 넣어도 되는데
2) 벡터와 인서트의 볼륨비로 1:1을 맞추면 인서트는 2ul을 넣어야 하잖아요?
물론 ligation 반응하는데 있어서 인서트가 많을수록 반응은 잘 일어나겠지만 1번과 2번의 볼륨 차이는 약 13배나 차이가 난다는 건데, 반응하는 물질의 양에 따라서 buffer나 salt농도는 다르게 해줘야 하지 않나요?
볼륨비로 하던, ng비로 하던 1:1을 하던, 1:3으로 맞추던 간에 10X ligation buffer의 양은 달라야 한다고 생각하거든요.
따라서 ligation할 때 buffer 등의 salt농도를 제대로 맞춰주지 못해서 생긴 문제로 transformation할 때에도 영향이 어느정도 있을거라고 생각하는데..
물론 조교님이 알려주신 프로토콜에 문제가 있을거라고는 생각은 안하지만 제가 전공지식이 너무 부족하고 실험도 처음이라 이해가 안가는 부분이 너무 많네요 ㅠㅠ 도와주세요..
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