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PCR이 제대로 안됬네요. 기존에 PCR이 잘 됬었었고 시약도 문제없으면, DNA template가 문제이니 새로 DNA를 추출하셔야 할 것 같네요
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ffpraise@naver.com
(비회원)
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22.10.23 22:11
1. primer는 10pM 1ul이 맞으시죠?
taq polymerase가 1kb/1min이면.. extension time을 1분 40초로 바꾸어보시죠..
제 생각도 template바꾸면 기존 조건으로 가능할 것으로 보이고요.
지금 상태에서 해결보려면 시간을 타이트하게 주지 말고 좀 더 주셔야 할 것 같습니다.
(gDNA가 보관 상태, 시간에 따라 quality, purity가 나빠질 수 있어서 기존보다 느슨하게 가져가셔야할 것 같아요.)
그리고 68도씨가 맞나요? 제품마다 틀리긴 하지만 일반적으로 72도씨일텐데... 매뉴얼에 68도씨이면 그대로 하시면 될 것 같아요.
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레벨1
ThomasAquinas
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22.10.24 12:55
사용하신 template DNA가 gDNA, plasmid DNA, 또는 PCR product인지는 모르겠으나,
1. 추출/정제한 template DNA의 상태가 안좋다. (Nuclease 때문에 DNA가 degradation된걸로 보입니다.)
2. 사용한 template DNA의 농도가 너무 높다.
이렇게 두 원인이 제일 먼저 떠오릅니다. 먼저 답변 해주신 분께서 언급하셨듯이 template DNA를 다시 fresh하게 정제해서 농도 측정 후, 정량을 맞춰 PCR을 다시 진행해보시는게 좋아보입니다.
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레벨1
도솔이89
(대학생)
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22.10.25 13:47
해당 샘플 그대로
1×, 10×, 100×, 1000×
이렇게 ITS1, 4 프라이머를 이용하여
PCR을 해본결과 4개 다 동일하게 잘나와서 DNA template가 상관없는거 같아 안바꾸고 있었는데, 새로 뽑으면 잘될까요
사진으로만 봐서는 template에 문제가 생겼거나, 제대로 PCR이 되지 않은것 같습니다. Annealing temp. 조절 해보셨나요?
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개느삼이
(비회원)
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22.10.27 10:05
DNA양이 많을 경우 smear하게 나오는 경우가 있습니다.
하지만 저는 Primer를 새로 구입해서 실험을 하는 것을 추천드립니다.
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레벨1
도솔이89
(대학생)
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22.10.27 13:23
DNA 추출 키트로 DNA 를 추출하니
몇개는 밴드가 잘보이고, 몇개는 희미하게 밴드를 형성하는 결과가 나왔습니다.
깔끔하게 DNA 를 뽑아야 밴드가 나오는 것 같네요.
답변 감사합니다.