1. 마우스 조직에 마우스 호스트 항체를 쓰면 당연히 2차 붙일 때 난리나죠. 이렇게 실험하지 않습니다. 2차 처리시 1차항체가 아닌 다른 부위에 비특이적인 결합이 생길 가능성이 존재하죠. 논문쓸때도 문제가 될텐데요.
가난한 실험실이라도 호스트가 다른 항체를 구입하세요.
2. 딱히 문제 없어보입니다. 항체에 따라 희석 배율은 달라질 수 있습니다.
3. 역시 가난한 실험실에서 주로 쓰는 방법입니다. 1차 항체는 3번이상 재사용하지 않습니다. 한 5번까지는 잘나오는거 같지만, 확실히 점점 감도 떨어지기도 하구요. 제 경우 계속 안나와서 확인해보니 재사용한 항체라 안나왔던거고 fresh한 항체 새로 사서 썼더니 바로 진하게 뜨더라구요.
돈을 아끼는 것도 좋지만... 결과가 한번에 잘 나오도록 최소한의 재사용 조건을 걸어두고 쓰는게 좋습니다.
3의 경우는 bsa 희석한데에 sodium azide 소량 넣어서 (0.03%던가 그래요) 냉장보관해서 쓰시면 잘 나오는건 꽤 오래 씁니다. 물론 극도로 안나오는 애들도 있으나 그런건 또 샘플 양부터도 많이 걸고 해야하니 예외로 치겠습니다
오히려 tbst 에 아무런 보존액 없이 희석해 얼렸다 녹였다 하시면서 쓰시면 degradation 빨리 일어날거같은데요...
- 2nd를 mouse를 사용하면 WB가 안됩니다.
- 1st mouse IgG를 2nd mouse IgG가 capture 불가능합니다.
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레벨2
kodo2001
(과기인)
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22.11.16 13:20
-비타민B님
너무 펙폭이라..ㅋㅋㅋㅋㅋ너무 맞는 말씀 해주셔서 이해가 잘 되었습니다. 감사합니다. 연구비는...제가 어쩔 수가 없는거 같습니다.. 사수한테 mouse 1차여도 나올 놈 나오고 니가 잘하면 나온다 조건 잡기 나름이다..라고만 해서 그렇게 배웠다보니... 너무 아쉽네요 ㅠㅠ
-ㅇㅇ님
말씀하신 것 잘 봤습니다. 원래 항체 주문 시에 항체 성분을 보고는 하는데 보통 sodium azide에 glycerol이 들어있는 것을 확인하고 주문하고는 합니다. 물론 옛날 항체는 제외하구요...
그리고 저도 진짜 안잡히는 항체(주로 receptor, 전사인자)도 많은데.. 예전에 배우기로 전사인자나 receptor는 경우에 따라 tissue도 50 ug씩 걸어야 한다고 배웠는데 맞는가 싶네요. 여전히 SERCA나 androgen receptor 등 너무 안나와서 시간 날 떄마다 다시 시도하고는 있습니다...ㅠㅠ
-speed님
1차 항체가 origin이 mouse인 항체가 랩에 10~20% 정도 있습니다.
기존에 human sample 연구 시에는 문제가 없없으나 저는 지금 mouse로 실험을 하는데 mouse tissue를 mouse primary antibody[ ex) b-actin ] 에 mouse 2nd antibody로 잡아야 하는... 등의 실험을 좀 많이할 상황이 생깁니다. 특히나 좀 보기 빡센 CYP 시리즈 등 같은 항체들도 가끔 mouse polyclonal 인 경우도 있어서 혹시라도 제가 western 상 다른 방법을 시도하면 더 잘 볼 수 있지 않을까 싶은 마음에 질문을 올리게 되었습니다 ㅠ
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레벨5
CBD 김선우
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22.11.16 14:18
마우스 샘플에 마우스유래 1차 항체와 anti-mouse IgG 2차항체를 쓰면 tissue종류에 따라 마우스의 IgG가 잡히는 경우가 있습니다(50kda 쯤 위치에 heavychain과 25kda쯤 위치에 light chain). anti-mouse IgG 2차항체 제품중에는 heavychain과 light chain이 intact한 antibody만(즉, 1차항체) 특이적으로 잡아내고 tissue 샘플에 포함된 IgG(denature되서 heavychain과 light chain이 분리된)는 잡아내지 않는 제품이 있습니다(Rockland 사 Trueblot). 마우스 to 마우스 웨스턴은 이런걸로 진행하기를 권장합니다.
1번 질문에 대한 답
mouse tissue를 mouse host antibody로 WB 해야되는데 잡밴드 때문에 target protein을 볼 수 없는 경우 방법이 있긴 합니다.
primary antibody를 biotinylation 해준 뒤, anti-biotin primary antibody (host rabbit)를 붙여주고, anti-rabbit HRP secondary antibody로 detection해주시면 됩니다. primary antibody를 2번 붙여준다고 생각하면 됩니다.
시간을 조금 단축하고 싶다면, primary antibody biotinylation 한 다음, anti-biotin-HRP conjugation antibody를 이용해서 detection하는 방법도 있습니다.
3번 질문에 대한 답
실험실마다 다른 protocol을 이용하는 것이라 딱이 정답이 없습니다.
TBS-T에 1% skim milk or BSA를 녹여서 primary antibody + sodium azide를 넣어서 사용하면 썩지 않고 계속 사용할 수 있습니다.
skim milk or BSA 없이 TBS-T에만 antibody 희석해서 사용해도 무방합니다. 다만, skim milk or BSA가 없으면 non specific band가 생길 가능성이 있습니다.